Bu video, memeli hücrelerde yeni sentezlenen RNA transkripsiyonunu görüntülemek için klik kimyası ve floresan mikroskobinin kullanımını göstermektedir. Enfekte ve kontrol hücreleri arasındaki floresan sinyallerini karşılaştırarak, viral enfeksiyonun konakçı transkripsiyonunu nasıl baskıladığını vurgulamaktadır.
Yöntem makalesi
Virüsle Enfekte Hücrelerde Transkripsiyonel Baskılanmanın Görüntülenmesi
57 görüntülenme
⸱
30 Eylül 2026
Bu makalede
Özet
Protokol
Hücrelerin Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 ile enfekte edilmesi ve yeni sentezlenen RNA'nın 5-ethynyl uridine (EU) ile işaretlenmesi
- İnsan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücrelerini, büyüme ortamı (%10 fetal bovine serum, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin içeren Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)) içinde 6 kuyucuklu bir doku kültürü plakasına ekleyin. Hücreler %80 - 100 konfluens seviyesine ulaşana kadar 37 °C ve %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
- Hücreleri 3 enfeksiyon multiplisitesi (MOI) ile MP-12 ile enfekte edin. En az iki enfekte edilmemiş kuyucuk ekleyin: bu kuyucuklardan biri enfekte edilmemiş kontrol olarak hizmet edecek, diğeri actinomycin D (ActD) ile işleme tabi tutulacaktır. Büyüme ortamını uzaklaştırın ve her bir kuyucuğa eklenen toplam hacim 400 μL olacak şekilde virüs stokunu seyreltin. 37 °C ve %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 1 saat inkübe edin.
- İnokulumu uzaklaştırın ve her kuyucuğa 2 mL taze büyüme ortamı ekleyin. 37 °C'de 12 saat inkübe edin.
NOT: Bu protokol başka bir virüs için uyarlanacaksa, işaretleme ve toplama için optimal zaman noktasını belirlemek amacıyla bir zaman seyri deneyi yapılması önerilir. Enfeksiyon zamanlarını kademeli olarak ayarlayarak, tüm örneklerin aynı anda işaretlenmesini, toplanmasını ve boyanmasını sağlayacak şekilde bu zaman seyrini düzenleyin.
- Enfeksiyondan 12 saat sonra (hpi), büyüme ortamını 0,5 mM EU içeren bir ortamla değiştirin. Sahte enfekte edilmiş (mock-infected) kuyucuklardan birine ayrıca 5 μg/mL ActD ekleyin. ActD, DNA bağımlı RNA sentezini inhibe ettiğinden, bu kuyucuk transkripsiyonel baskılama için kontrol görevi görecektir. Hücreleri inkübatöre geri koyun.
- 13. saatte (hpi), hücreleri bir kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve tripsinizasyon yoluyla toplayın. Toplanan hücreleri, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) içeren PBS ile üç kez yıkayın.
NOT: Hücre parçalanmasını önlemek için bu ve sonraki adımlarda hücreleri 500-1.000 x g'den daha hızlı santrifüj etmeyin. Çöktürmek için hücreleri 1-2 dakika santrifüj edin.
NOT: Click reaksiyonu sonrası yüzey immünboyama planlanıyorsa, hücreleri bunun yerine kauçuk bir polisman (rubber policeman) veya tek kullanımlık hücre kazıyıcı kullanarak toplayın.
- Hücreleri 1 mL %4 paraformaldehit (PFA) içinde yeniden süspand ederek tespit edin (fix) ve oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe edin.
- Her kuyucuk için 1 mL PBS-EDTA ile bir kez yıkayın. Hemen adım 2'ye geçin.
NOT: RNA bu aşamada uzun süre tutulursa dejenere olduğu için hemen click reaksiyonuna geçilmesi önemlidir. Benzer şekilde, bir zaman seyri deneyi yürütülüyorsa, tüm örneklerin aynı anda işaretlendiğinden, tespit edildiğinden ve boyandığından emin olun.
İşaretli RNA'nın Tespiti İçin Click Reaksiyonu
- PBS içinde %0,2 Triton X-100'den 1 ml ekleyerek hücreleri permeabilize edin. Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika inkübe edin.
NOT: 2.1 ile 2.3 adımlarında kullanılan tüm çözeltilerin nükleaz içermemesi gerekir.
- Her kuyucuk için 1 ml PBS ile üç kez yıkayın.
- Lamelleri 12 kuyucuklu plaktan çıkarın ve nemli bir hazneye aktarın. Her lameli 50 - 100 μl click boyama çözeltisi (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO4, 20 μM floresan azit [maksimum eksitasyon/emisyon: 590/617 nm], 100 mM askorbik asit) ile kaplayın. Oda sıcaklığında (RT) karanlıkta 1 saat inkübe edin.
NOT: Nemli hazneyi oluşturmak için, 10 cm çapındaki bir hücre kültürü veya petri kabının tabanını plastik parafin film ile kaplayın. Kabın kenarlarının iç kısmını nemli kağıt havlularla döşeyin. Lamelleri plastik parafin filmin üzerine yerleştirin.
NOT: Bu veya protokoldeki herhangi bir adım sırasında lamellerin kurumamasına dikkat edin. Boyama çözeltisinin, lameller nemli hazneye yerleştirildikten hemen sonra eklenmesi en iyisidir.
NOT: Click boyama çözeltisini bu adımdan hemen önce taze olarak hazırlayın. 1,5 M Tris pH 8,5, 100 mM CuSO4 ve 500 mM askorbik asit stok çözeltileri 4 °C'de saklanabilir. Ancak, sararmış olan herhangi bir askorbik asit stok çözeltisini imha edin.
NOT: Floresan mikroskobunuzdaki filtrelerle uyumlu bir florofor seçtiğinizden emin olun.
- Lamelleri nemli hazneden çıkarıp yeni bir 12 kuyucuklu plaka içine yerleştirin ve her kuyucuk için 1 ml PBS ile üç kez yıkayın.
- Bir mikroskop lamı üzerine bir damla (yaklaşık 15 μl) Fluoromount-G damlatarak lamelleri monte edin. Lameli H2O'ya daldırın, kenarını bir kağıt havluya değdirerek fazla H2O'yu uzaklaştırın ve hücreli yüzeyi aşağı gelecek şekilde Fluoromount-G damlasının içine yerleştirin. 5 dakika havada kurumaya bırakın.
NOT: Ters mikroskopta görüntüleme yapılacaksa, Fluoromount-G'nin 4 °C'de gece boyunca katılaşmasına izin verin veya kenarlarını şeffaf oje ile mühürleyerek lamelleri mikroskop lamına sabitleyin.
NOT: Lamlar hemen görüntülenebilir veya karanlıkta 4 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 5-Etinil üridin | Berry Associates | PY 7563 | 100 mM stok için DMSO içinde çözün |
| 12-mm Yuvarlak lamel | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| Aktinomisin D (ActD) | Sigma | 9415 | 10 mM stok için DMSO içinde çözün |
| Floresans Mikroskobu | ör. Olympus IX71 | ||
| CuSO₄ | Sigma | C-8027 | 100 mM stok için H₂O içinde çözün |
| DMEM (Dulbecco modifiyeli kartal besiyeri) | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS (Fetal bovin serumu) | Invitrogen | 16000044 | |
| Floresan azid (Alexa Fluor 594-bağlı) | Invitrogen | A10270 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-askorbik asit | Sigma | A-5960 | 500 mM için H₂O içinde çözün |
| Paraformaldehit | Sigma | 158127 | |
| Penisilin-Streptomisin | Invitrogen | 15140122 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Tripsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Trizma bazı | Sigma | T-1503 | 1.5 M stok için H₂O içinde çözün, pH 8.5 |
