Akış Sitometrisi Kullanılarak Virüs Kaynaklı Konak Transkripsiyonel Baskılanmasının Analizi

Özet

Kaynak: Kalveram, B., et al. Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis. J. Vis. Exp. (2013)

Bu video, konak hücre transkripsiyonunun virüs kaynaklı baskılanmasını ölçmek için klik kimyası ve akış sitometrisi kullanımını göstermektedir. Memeli hücreleri, konak transkripsiyon faktörü kompleksini bozan nükleer bir virülans proteini eksprese eden bir virüsle enfekte edilirken, kontrol hücreleri transkripsiyonel olarak aktif kalır. 5-ethynyl uridine inklüzyonu, yeni sentezlenen mRNA'yı işaretleyerek, çift floresan deteksiyonu yoluyla enfekte ve kontrol hücrelerdeki transkripsiyonel aktivitenin kantifikasyonuna olanak tanır.

Protokol

1. Hücreleri MP-12 ile Enfekte Edin ve Yeni Sentezlenen RNA'yı 5-etininilüridin (EU) ile İşaretleyin

1. 293 hücrelerini, büyüme ortamı ( %10 fetal bovine serum, 100 U/ml Penisilin, 100 μg/ml Streptomisin içeren DMEM) ile 6 kuyucuklu bir doku kültürü plağına ekleyin. Hücreler %80 - 100 konfluense ulaşana kadar 37 °C ve %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
2. Hücreleri 3 m.o.i. değerinde MP-12 ile enfekte edin. En az iki adet enfekte edilmemiş kuyucuk ekleyin: bu iki kuyucuktan biri enfekte edilmemiş kontrol olarak hizmet edecek, diğeri ise 1.4 adımında ActD ilele tedavi edilecektir. Büyüme ortamını uzaklaştırın ve virüs stokunu, her kuyucuğa eklenen toplam hacim 400 μl olacak şekilde seyreltin. 37 °C ve %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 1 saat boyunca inkübe edin.
3. İnokülumu uzaklaştırın ve her kuyucuğa 2 ml taze büyüme ortamı ekleyin. 37 °C'de 12 saat boyunca inkübe edin.

NOT: Bu protokol başka bir virüsle kullanılmak üzere uyarlanacaksa, etiketleme ve toplama için en uygun zaman noktasını belirlemek amacıyla bir zaman seyri deneyi yapılması önerilir. Enfeksiyon sürelerinin kademeli olarak ayarlandığı ve tüm örneklerin aynı anda etiketlenebileceği, toplandığı ve boyanabileceği bir zaman seyri planlayın.

4. Enfeksiyondan 12 saat sonra (12 h.p.i.), büyüme besiyerini 0,5 mM EU içeren bir besiyeri ile değiştirin. Mock enfekte kuyucuklardan birine ayrıca 5 μg/ml ActD ekleyin. ActD, DNA bağımlı RNA sentezini inhibe ettiği için bu işlem transkripsiyonel supresyon için kontrol görevi görecektir. Hücreleri inkübatöre geri yerleştirin.
5. Enfeksiyondan 13 saat sonra (13 h.p.i.), hücreleri bir kez PBS ile yıkayın ve hücrelerin tripsinizasyonu ile hasat edin. Hasat edilen hücreleri 1 mM EDTA içeren PBS (PBS-EDTA) ile üç kez yıkayın.

NOT: Hücrelerin parçalanmasını önlemek için bu ve sonraki adımlarda, hücreleri 500 - 1,000 x g'den daha hızlı santrifüjlemeyin. Çöktürmek için hücreleri 1-2 dk santrifüjleyin.

NOT: Klik reaksiyonunu takiben bir yüzey immün boyaması planlanıyorsa, bunun yerine kauçuk bir polisçi veya tek kullanımlık hücre kazıyıcı kullanarak hasat yapın.

6. Hücreleri 1 ml %4 PFA içinde yeniden süspanse ederek tespit edin ve oda sıcaklığında 30 dk inkübe edin.
7. Kuyu başına 1 ml PBS-EDTA ile bir kez yıkayın. Hemen 6. adıma geçin.

NOT: RNA, bu aşamada uzun süre bekletildiğinde degrade olduğu için click reaksiyonuna derhal geçilmesi önemlidir. Benzer şekilde, bir zaman seyri deneyi gerçekleştiriliyorsa, tüm örneklerin aynı anda işaretlendiğinden, fikse edildiğinden ve boyandığından emin olun.

2. İşaretli RNA'yı Tespit Etmek İçin Click Reaksiyonu

1. Hücreleri, PBS içerisinde %0,2 Triton X-100 içeren 0,5 ml çözeltide yeniden süspanse ederek permeabilize edin. Oda sıcaklığında 10 dk inkübe edin.

NOT: 2.1 ile 2.3 arasındaki adımlarda kullanılan tüm çözeltilerin nükleaz içermemesi gerekir. Bu adım sırasında hücreler uygun şekilde çökelmezse, santrifüj süresini 5 dakikaya çıkarın. Hücreler FACS tamponuna askıya alındığında çökelme davranışı iyileşecektir. .

2. 1 ml PBS ile bir kez yıkayın.

NOT: Bu adımda EDTA kullanmayın, çünkü bu durum click reaksiyonu için gerekli olan Cu²⁺ iyonlarını şelatlayacaktır.

3. Hücreleri 200 μl click boyama çözeltisinde (100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO4, floresan boya ile işaretlenmiş 200nM azid [maksimum eksitasyon/emisyon: 650/665 nm], 100 mM askorbik asit) yeniden süspande edin. Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin.

NOT: Click boyama çözeltisini bu adımdan hemen önce taze olarak hazırlayın. 1,5 M Tris pH 8,5, 100 mM CuSO₄ ve 500 mM askorbik asit stok çözeltileri 4 °C'de saklanabilir. Ancak, sararmış olan tüm askorbik asit stok çözeltilerini atın. Bu adım sırasında hücreler topaklaşırsa, birkaç kez pipetleyerek yeniden süspanse edin. Akış sitometreniz tarafından tespit edilebilen bir florofor seçtiğinizden emin olun. Ayrıca, click boyama prosedürüne tabi tutulmamış enfekte hücrelerden oluşan bir örnek hazırlayın; bunlar akış sitometresinin kalibrasyonu için gerekecektir. Ya enfekte hücrelerin yarısını kullanın ya da adım 1.2'de ek bir enfekte kuyucuk ekleyin.

FACS tamponu (1 mM EDTA ve %0,5 (w/v) BSA içeren PBS) ile iki kez yıkayın.

3. Viral Protein Ekspresyonunu Tespit Etmek İçin İmmünofloresan

1. Hücreleri FACS tamponu ile seyreltilmiş 200 μl primer antikor (anti-RVFV) (1:10.000) içinde yeniden süspande edin ve karanlıkta, RT'de 1 saat inkübe edin.

NOT: Alternatif olarak, bu adım 4 °C'de, karanlıkta gece boyunca (O/N) gerçekleştirilebilir.

NOT: Ayrıca, click boyama işlemine tabi tutulan ancak immünoboyama yapılmayacak olan enfekte edilmemiş hücrelerden bir örnek hazırlayın; bunlar akış sitometresinin kalibrasyonu için gereklidir. Ya mock enfekte edilen hücrelerin yarısını kullanın ya da adım 1.2'de ek bir enfekte edilmemiş kuyucuk ekleyin.

NOT: Bu protokolü farklı bir virüsle kullanmak için uyarlarken, öncelikle primer antikorunuz için optimal dilüsyonu belirleyin.

2. Hücreleri FACS tamponu ile iki kez yıkayın.
3. Hücreleri, FACS tamponu ile seyreltilmiş (1:1.000) 200 μl sekonder antikorda (florokrom ile konjuge edilmiş anti-fare IgG [maksimum eksitasyon/emisyon: 495/519 nm]) yeniden süspande edin ve oda sıcaklığında, karanlıkta 1 saat inkübe edin.
4. Hücreleri FACS tamponu ile bir kez yıkayın.

NOT: Bu aşamada hücreler, karanlıkta 4 °C'de gece boyunca (O/N) saklanabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
5-ethynyl-uridine	Berry Associates	PY 7563	100 mM stok için DMSO içinde çözün
12-mm yuvarlak lamel	Fisherbrand	12-545-82
5 ml polistiren tüpler	BD Biosciences	352058
Aktinomisin D (ActD)	Sigma	9415	10 mM stok için DMSO içinde çözün
Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG	Invitrogen	A-11029
Sığır Serum Albümini (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO₄	Sigma	C-8027	100 mM stok için H2O içinde çözün
DAPI	Sigma	D-9542	5 mg/ml stok için H2O içinde çözün
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
florasan azid (Alexa Fluor 594-bağlı)	Invitrogen	A10270
florasan azid (Alexa Fluor 657-bağlı)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-askorbik asit	Sigma	A-5960	500 mM için H2O içinde çözün
kağıt filtre	VWRbrand	28333-087
paraformaldehit	Sigma	158127
Penisilin-Streptomisin	Invitrogen	15140122
poli-L-lizin (MW ≥ 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trizma bazı	Sigma	T-1503	1.5 M stok için H2O içinde çözün, pH 8.5
Tripsin-EDTA	Invitrogen	25200056
Floresans Mikroskobu			örneğin Olympus IX71
Akış Sitometresi			örneğin BD Biosciences LSRII Fortessa