Gen Transferi için Retroviral Partikül Üretimi

Özet

Kaynak: Zjablovskaja, P., et al., Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. J. Vis. Exp. (2018)

Bu video, hedef hücrelere genetik modifikasyon, fonksiyonel analizler veya soy farklılaşma çalışmaları gibi sonraki uygulamalar için stabil gen aktarımını mümkün kılan, insan böbreği türevli paketleme hücrelerinin transfekte edilmesi yoluyla rekombinant retroviral partiküllerin üretimini göstermektedir.

Protokol

1. Retrovirüs üretimi
   1. Bosc23 hücrelerinden oluşan tek hücre süspansiyonunu (6 × 10⁶) 16 cm'lik bir Petri kabına ekin ve kültür konfluensliği %80'e ulaşana kadar (24 sa) %10 FBS (fetal sığır serumu) içeren 18 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) içinde kültüre edin.
      NOT: Hücreler kültürde tek tabaka halinde büyümeli ve küme oluşturmamalıdır. Hücre sayımı farklı yöntemler kullanılarak gerçekleştirilebilir (burada sunulan diğer protokoller için de geçerlidir). Az sayıda örnek olması durumunda, Bürker kamarası kullanılarak mikroskop altında manuel sayım önerilir. Bu durumda, ölü hücrelerin dışlanması için Trypan blue kullanın. Hücreleri, PBS (fosfat tamponlu salin) içindeki %0,4'lük Trypan Blue ile 1:1 oranında karıştırın. Çok sayıda örneğin sayımını gerçekleştirmek için otomatik bir hücre sayıcı kullanılabilir.
   2. 40 µg retroviral konstrüktü (MSCV gibi), 20 µg pCL-Eco (paketleme vektörü), 80 µl PEI (polietilenimin) ve 2 mL düşük serumlu besiyerini (örneğin, antibiyotiksiz Opti-MEM (Minimum Essential Medium)) birleştirin. Bu karışımı oda sıcaklığında (RT) 20 dk inkübe edin.
   3. Bosc23 hücrelerinin besiyerini dikkatlice %2 FBS ile desteklenmiş 16 mL DMEM ile değiştirin. Besiyerini kullanmadan önce 37 °C'ye kadar ön ısıtma yapın.
      NOT: Transfeksiyon verimliliğini düşürebilecekleri için transfeksiyon sırasında antibiyotik kullanmayın.
   4. 1.2'de hazırlanan karışımı Bosc23 kültürüne damla damla ve dikkatlice ekleyin ve 37 °C'de 4 sa inkübe edin. PEI toksisitesi nedeniyle inkübasyonu 6 sa'den kısa tutun.
   5. İnkübasyondan sonra, Bosc23 besiyerini %10 FBS içeren 18 mL ön ısıtmalı DMEM ile değiştirin ve hücreleri 37 °C'de 48 sa kültüre edin. Kapları biyogüvenlik seviyesi 2 bir laboratuvara yerleştirin ve standart güvenlik prosedürlerini izleyin.
   6. Ekotropik retroviral partiküller içeren Bosc23 besiyerini 25 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 50 mL'lik konik bir tüpe toplayın ve 4 °C'de saklayın.
      NOT: (Önemli) Yüksek titreli bir virüs üretmek için transfeksiyon verimliliği %90'a ulaşmalıdır.
   7. Bosc23 hücrelerine 18 mL ön ısıtmalı %10 FBS'li DMEM ekleyin ve 24 sa kültüre edin.
   8. 1.6 adımını tekrarlayın.
      NOT: Viral bütünlüğü korumak için 1.6 ve 1.8'den elde edilen retroviral süpernatantlar, aynı sıcaklığa (4 °C) ulaştıklarında birleştirilebilir.
   9. Viral süpernatantlarda Bosc23 kontaminasyonunu önlemek için toplanan virüsü 4 °C'de 10 dk boyunca 1500 × g'de santrifüjleyin. Virüsü alikotlayın, kuru buz veya sıvı azot kullanarak şok dondurun ve -80 °C'de saklayın. Ancak, taze hazırlanan virüsün enfeksiyon verimliliği açısından donmuş stoklardan daha kaliteli olduğunu unutmayın.
      NOT: (Önemli) Viral degradasyona yol açtığı için virüsün tekrarlayan dondurma/çözme işlemlerinden kaçının.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15028
Opti-MEM ((Minimum Essential Medium) - Azaltılmış Serum Ortamı	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	31985-047	L-Glutamin, Fenol Kırmızısı
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270	HEK293T, NIH3T3 ve BOSC23 hücrelerinin kültürü için kullanılır
Penisilin	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	P3032
Streptomisin	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	S9137	Streptomisin sülfat tuzu tozu
Gentamisin	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	G1914
Polietilenimin	Polyscience, Warrington, PA, USA	23966	Lineer, MW 25,000 (PEI 25000)