T7 Ekspresyon Sistemi Kullanılarak GFP Etiketli Rekombinant Respiratuar Sinsitiyal Virüs Üretimi

Özet

Kaynak: Bouillier, C. et. al., Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses. J. Vis. Exp. (2019)

Bu video, T7 tabanlı bir ters genetik sistem kullanılarak yeşil floresan protein (GFP) eksprese eden rekombinant bir respiratuar sinsitiyal virüsün üretimini göstermektedir. Viral proteinleri kodlayan plazmidlerin ve GFP etiketli bir genomun ko-transfeksiyonu, protein ekspresyonuna yol açar ve virüs kurtarma işlemini başlatır.

Protokol

1. Rekombinant Virüsün Kurtarılması ve İlk Pasajı

NOT: Aşağıdaki tüm adımları, sınıf II bir güvenlik kabini kullanarak steril bir ortamda gerçekleştirin.

1. Transfeksiyondan bir gün önce, BSRT7/5 hücre hattının tam besiyerinde 5 x 10⁵ hücre/mL konsantrasyonunda bir süspansiyonunu hazırlayın. Bir 6 kuyucuklu plakadaki her kuyucuğa 2 mL hücre süspansiyonu dağıtın. Kurtarılacak her virüs için bir kuyucuk ve negatif kontrol için bir ek kuyucuk hazırlayın. Plağı 37 °C ve %5 CO₂ ortamında inkübe edin. Ertesi gün hücrelerin %80–90 konfluense ulaştığını kontrol edin.
2. Ters genetik respiratuar sinsityal virüs (RSV) vektörleri olan p-RSV-GFP ve p-RSV-M2-1-GFP'nin yanı sıra p-N, p-P, p-L ve p-M2-1'i çözün. Kurtarılacak her virüs için bir tüpte 1 µg p-N ve p-P, 0.5 µg p-L, 0.25 µg p-M2-1 ve 1.25 µg p-RSV (GFP veya M2-1 GFP) karıştırın.
   NOT: Polimeraz kompleksinin viral proteinleri (N, P, L ve M2-1) için farklı ekspresyon vektörleri kullanılabilir; ancak proteinler arasındaki oran korunmalıdır. p-RSV vektörünü boş bir vektörle değiştirerek negatif kontrolü gerçekleştirin.
3. Transfeksiyona geçin (Materyaller Tablosuna bakınız).
   1. Karıştırılmış vektörlere 250 µL düşük serumlu besiyeri ekleyin. Başka bir tüpte, 10 µL transfeksiyon reaktifini 250 µL düşük serumlu besiyerinde seyreltin. Her iki tüpü hafifçe vorteksleyin ve 5 dk bekleyin. Her iki tüpün içeriğini karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dk bekleyin.
   2. BSRT7/5 hücrelerini 1 mL düşük serumlu besiyeri ile durulayın ve her kuyucuğa antibiyotik içermeyen %10 fetal calf serum (FCS) içeren 1.5 mL Minimal essential medium (MEM) dağıtın. Gerekiyorsa, adım 1.3.1'de açıklanan inkübasyon tamamlanana kadar 37 °C ve %5 CO₂ ortamında inkübe edin.
   3. 20 dakikalık inkübasyon süresi dolduğunda, adım 1.3.1'de hazırlanan transfeksiyon karışımından 500 µL bir kuyucuğa ekleyin. Hücreleri 3 gün boyunca 37 °C ve %5 CO₂ ortamındaki inkübatöre yerleştirin. Transfeksiyon sırasında hücrelerin kültür besiyerini değiştirmeyin.
4. Kurtarma verimliliğini izlemek için, GFP filtresini kullanarak, ters floresan mikroskobunda 20x büyütmede günde 1 kez yeşil floresan protein (GFP) floresansını (488 nm'de eksitasyon ve 515–535 nm'de emisyon) gözlemleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BSRT7/5		ticari olarak mevcut değil	Bkz. referans 22. Buchholz et al. 1999
Gözlemler için floresan mikroskobu	Olympus	IX73 Olympus mikroskobu
Videomikroskopi için floresan mikroskobu	Olympus	ScanR Olympus mikroskobu
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
HEPES ≥99.5%	Sigma	H3375
L-Glutamin (200 mM)	ThermoFisher Scientific	25030024
Lipofactamine 2000 reaktifi	ThermoFisher Scientific	11668019	Adım 2.3.'teki protokol bu reaktif için optimize edilmiştir.
MEM (10x), glutamin içermeyen	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, GlutaMAX takviyeli	ThermoFisher Scientific	41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5%	Sigma	M7506
Opti-MEM I düşük serumlu besiyeri	ThermoFisher Scientific	51985-026
Plazmidler		ticari olarak mevcut değil	Bkz. referans 21. Rameix-Welti et al. 2014