Enfeksiyöz Respiratuar Sinsityal Virüsün Kantifikasyonu için Plak Titrasyon Analizi

Özet

Kaynak: Bouillier, C., et al. Rekombinant Respiratuvar Sinsityal Virüslerin Üretimi, Amplifikasyonu ve Titrasyonu. J. Vis. Exp. (2019)

Bu video, epitel hücre monokatmanlarındaki enfeksiyöz rekombinant respiratuar sinsityal virüsün (RSV) miktarını belirlemek için kullanılan bir plak titrasyon analizini göstermektedir. Videoda, konak hücrelerin seri dilüye edilmiş viral süspansiyonlarla enfekte edilmesi, viral yayılımın selüloz bazlı yarı katı bir overlay ile sınırlandırılması ve sitopatik etkiler sonucunda lokalize plakların oluşumu sunulmaktadır. Prosedür, viral titreyi belirlemek ve RSV enfektivitesini değerlendirmek amacıyla boyama, dekontaminasyon ve plak sayımı ile sona ermektedir.

Protokol

1. Plak Titrasyon Analizi

1. Titrasyon plaklarını, titrasyon analizi yapılmadan bir gün önce hazırlayın (bir tüp virüsü titrasyonu için altı kuyucuk gerekecektir). Kuyucuklara 5 x 10^5 hücre/mL konsantrasyonunda 1 mL İnsan epitel tip-2 (HEp-2) hücresi ekleyin. × 10⁵ tam besiyerinde hücre/mL.
2. Ertesi gün, steril bir mikrokristalin selüloz süspansiyonu (%2,4 [a/h] suda) hazırlayın (Materyaller Tablosuna bakınız).
   1. Standart bir manyetik karıştırıcı kullanarak, 2,4 g mikrokristalin selüloz tozunu 100 mL distile su içerisinde toz tamamen çözünene kadar (genellikle 4–12 saat) dağıtın. Süspansiyonu şu değerlerde otoklavlayın: 121 °C 20 dakika boyunca bekletin ve kullanmadan önce oda sıcaklığında saklayın.
      NOT: Bu koşullar altında süspansiyon 1 yıl boyunca stabildir.
   2. Çözeltiyi steril bir ortamda açtıktan sonra, şu sıcaklıkta saklayın: 4 °C 6 ay boyunca. Homojen olduğundan emin olmak için süspansiyonu kullanmadan önce her zaman (elle çalkalayarak veya vorteksleyerek) karıştırın.
3. 2'yi hazırlayın× steril bir ortamda minimum esansiyel besiyeri (MEM). Ticari MEM'i 10 kat seyreltin× steril su ile ve L-glutamin, 1.000 ünite/mL penisilin ve 1 mg/mL streptomisin ekleyin. Seyreltiyi kuvvetlice çalkalayın ve şurada saklayın: 4 °C.
   NOT: 1.4–1.10 arasındaki adımları, sınıf II biyogüvenlik kabini kullanarak steril bir ortamda gerçekleştirin.
4. İçeriğinde şunlar bulunan altı tüp hazırlayın: 900 µL titre edilecek her virüs başına fetal dana serumu (FCS) içermeyen MEM (titrasyon tüpleri). Virüs alikotlarını çözdürün, 5 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin ve aktarın 100 µL ilk titrasyon tüpüne.
5. On katlık bir dilüsyon gerçekleştirin 6×, şu şekilde. Ekleyin 100 μL virüsün 900 μL ilk tüpteki besiyerinin, tüpün kapağını kapatın ve içeriğini birkaç saniye boyunca vorteksleyerek karıştırın. Pipet ucunu değiştirin, ekleyin 100 µL ilk dilüsyondan itibaren 900 µL ikinci tüpteki besiyerinden, tüpün kapağını kapatın ve vorteksleyin. Bu işlemi altıncı tüpe kadar tekrarlayın.
   NOT: Her dilüsyon için pipet ucunun değiştirilmesi çok önemlidir.
6. Virüs adını ve kat dilutionlarını HEp-2 12 kuyucuklu plakalara yazın. Boyama sırasında (adım 1.9) ayrılabilme ihtimaline karşı, plakayı ve kapağını eşleştirecek bir işaret koyun. Plakalardaki besiyerini uzaklaştırın ve dağıtın 400 µL her kuyucuğa bir dilüsyon gelecek şekilde. Plakları şu sıcaklıkta inkübe edin: 37 °C virüs adsorpsiyonu için 2 saat boyunca.
   NOT: Her inokülasyon arasında pipet ucunu değiştirin veya aynı uçla en düşük konsantrasyondan en yükseğe doğru ilerleyin. Hücrelerin kurumasını önlemek için sınırlı sayıda plakla (1 ila 2) eş zamanlı olarak inokülasyon yapın.
7. Mikrokristalin selüloz kaplamasını, virüs adsorpsiyonu sırasında hazırlayın (taze hazırlama). 100 mL kaplama elde etmek için 10 mL %2,4'lük mikrokristalin selüloz süspansiyonu ile 10 mL %2'lik× MEM ve %2 FCS içeren 80 mL MEM.
   1. 2'nin pH değerini ayarlayın× Renk indikatörünü takip ederek, %7,5'lik steril sodyum bikarbonat çözeltisi ile MEM'i yaklaşık 7,2'ye ayarlayın. Mikrokristalin selüloz süspansiyonunu ve MEM'i ekleyip kuvvetlice karıştırın.
8. 2 saatlik inkübasyonun sonunda, inokülumu çıkarmadan 12 kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna 2 ila 3 mL overlay ekleyin. Yüksek viral titreli inokülumların komşu kuyucukları kontamine etmemesine dikkat edin. Plağı şu koşullarda inkübe edin: 37 °C ve %5 CO2₂ 6 gün boyunca. İnkübasyon sırasında plakayı ve inkübatörü hareket ettirmeyiniz.
9. Kristal viyole çözeltisi (%8 kristal viyole [h/h], %2 formaldehit [h/h] ve suda %20 etanol [h/h]) kullanarak hücreleri boyama işlemine geçin.
   1. Biyogüvenlik kabininin çalışma yüzeyini bir örtü ile koruyun (kristal viyole yüzeyleri güçlü bir şekilde renklendirir).
   2. Mikrokristalin selüloz üst tabakasını kaldırmak için plakaları hafifçe sallayın. Süpernatantları uzaklaştırın ve hücreleri 2 kez yıkayın× 1 ile× fosfat tamponlu salin (PBS). Hücrelerin kurumasını önlemek için plakaları tek tek işleme alın. 1–2 mL kristal viyole çözeltisi ekleyin ve 10–15 dakika bekleyin. Sonraki plakaların boyanmasında tekrar kullanılabilecek olan çözeltiyi uzaklaştırın.
   3. Plakları ve kapakları birkaç saniye boyunca taze çamaşır suyuna batırın ve ardından musluk suyuyla iyice yıkayın. Plakların ve kapakların çamaşır suyu ile dekontamine edildiğini unutmayın.
   4. Plakaları ve kapaklarını kağıt havluların üzerine koyun ve kurumaya bırakın. Suyla durulama işleminden sonra plakaları ortam sıcaklığında kurutun ve oda sıcaklığında saklayın. Uzun süreli saklama durumlarında (aylarca), rengi korumak için plakaları ışıktan koruyun. Hücreler renklerini kaybederse, kristal viyole ile yeniden boyanabileceklerini unutmayın.
10. Virüs titlerini hesaplayın. Kuru plakların kuyucuklarında, çıplak gözle görülebilen plakları sayın. Farklı dilüsyonlardaki plak sayısının tutarlı olduğunu (her dilüsyon arasında 10 kat faktör) kontrol edin. Plakların en kolay sayılabildiği kuyucuğu seçin. Plak sayısını, inokülum hacmine ve dilüsyona göre değerlendirin.
    NOT: Sunulan örnekte yer alan Şekil 1, 10 dilüsyonunda 21 plak sayılır^-5 seyreltme. Bunlar şu titre değerine karşılık gelmektedir:

Sonuçlar

Şekil 1: Plak analizi kullanılarak RSV titrasyonunun belirlenmesi. (A) 12 kuyucuklu bir plakadaki plak titrasyon analizi sonuçları. Tek bir viral stokun seri dilüsyonları ile enfekte edilen altı kuyucuk gösterilmiştir. Dilüsyonlar 10 tabanlı logaritma ile belirtilmiştir. İlk üç dilüsyonla enfekte edilen hücrelerin tamamı kopmuştur. 10^-4, 10^-5 ve 10^-6 dilüsyonlarında gözlemlenen plak sayıları tutarlıdır. (B) Plak sayımının gösterimi (sarı sayılar). Yeşil yıldız, hücre tabakasındaki çizikleri belirtmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kristal viyole çözeltisi	Sigma	HT90132
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
MEM (10x), glutamin içermeyen	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, GlutaMAX takviyeli	ThermoFisher Scientific	41090-028
Sodyum bikarbonat %7.5 çözeltisi	ThermoFisher Scientific	25080094
Penisilin-Streptomisin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122