Radyoetiketli bir Ters Transkriptaz Deneyi ile Viral Replikasyon Kapasitesinin Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Claiborne, D. T. et al. A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses. J. Vis. Exp. (2014)

Bu video, radyomarked reverse transcriptase deneyi kullanılarak viral replikasyon kapasitesinin değerlendirilmesini göstermektedir. Progeny virionlar içeren kültür süpernatantları, radyomarked bir nükleotid içeren bir reverse transkripsiyon karışımına eklenir. İnkorpore olan sinyal, viral çıktıyı ve replikasyon verimliliğini yansıtır. Test ve wild-type örnekler arasındaki sinyalleri tespit etmek ve karşılaştırmak için fosfor görüntüleme kullanılır.

Protokol

1. Hücre Kültürü Süpernatantlarında Ters Transkriptaz (RT) Analizi

1. Radyoaktif malzemelerle kullanım için biyogüvenlik seviyesi 3 (BSL-3) tesisinde bir biyolojik güvenlik kabini hazırlayın.
   1. Kabine emici kağıt yerleştirin ve aspiratörü radyoaktif kullanım için belirlenmiş bir aspiratörle değiştirin. 
      NOT: Tüm radyoaktif atıklar, güvenlik düzenlemelerine uygun olarak uygun şekilde bertaraf edilmelidir.
2. RT master mix'in her 1 ml'lik alikvotuna 10 mCi/ml konsantrasyonunda 1-2 µl [α-³³P]deoksitimidin trifosfat (dTTP) ve 4 µl 1 M ditiotreitol (DTT) ekleyin (bkz. Tablo 1).
3. RT master mix, DTT ve [α-³³P] dTTP içeren her bir 1,5 ml'lik mikro santrifüj tüpünü 1.000 µl'lik bir pipetle dikkatlice karıştırın ve steril bir hazneye aktarın.
4. Etiketli RT karışımından 25 µl'yi 96 kuyucuklu ince duvarlı bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) plakasının her kuyucuğuna dağıtın. 
   NOT: Pozitif kontrol (MJ4 yaban tip (WT) enfeksiyonu) ve negatif kontrol (Mock enfeksiyonu) için yer ayırın.
5. Her bir süpernatanttan 5 µl'yi RT master mix içeren PCR plakasına ekleyin.
6. PCR plakasını yapışkan folyo kapakla kapatın ve bir termosikletörde 37 °C'de 2 saat inkübe edin. Güvenlik nedeniyle, pipet uçlarını Amphyl ile durulayın ve uçları, daha sonra radyoaktif atık olarak bertaraf edilecek olan Amphyl atığı içeren küçük bir kaba atın.
7. İnkübasyondan sonra, 200 µl'lik çok kanallı bir pipet kullanarak folyo kapakta küçük delikler açın. 
   NOT: Pipet uçları kuyucuktaki sıvıya değerse, bir sonraki sütuna veya satıra geçmeden önce uçları değiştirin.
8. Numuneleri 5 kez karıştırın ve her numuneden 5 µl'yi DE-81 kağıdına aktarın. 10 dakika havada kurutun.
9. Blotları 1x salin-sodyum sitrat (SSC) ile 5 kez, ardından %90 etanol ile her yıkama için 5 dakika olacak şekilde 2 kez yıkayın. Havada kurumaya bırakın.
   1. Her bir blotu, sandviç saklama kutusu gibi ayrı bir yıkama kabına yerleştirin, blotu kaplayacak kadar yıkama tamponu (1x SSC veya %90 etanol (EtOH)) ekleyin ve 5 dakika boyunca çalkalayın.
   2. Yıkama tamponunu ayrı bir kaba boşaltın ve işlemi tekrarlayın. NOT: İlk 3 yıkama radyoaktif kabul edilir ve uygun şekilde bertaraf edilmelidir. Son 2 yıkama normal şekilde bertaraf edilebilir.
10. Kuruduktan sonra, blotu dikkatlice Saran wrap ile sarın ve oda sıcaklığında, sıkıca kapatılmış bir kaset içinde gece boyunca fosfor ekrana maruz bırakın.
11. Fosfor ekranları bir fosfor imager ile analiz edin ve radyoaktif transkriptleri nicelleştirin.
12. OptiQuant yazılımını kullanarak her bir radyoaktif sinyalin etrafına bir daire çizin. Replikasyon eğrileri oluşturmak için Dijital Işık Birimi (DLU) değerlerini grafikleyin.
13. Replikasyon kapasite skorları oluşturmak için, DLU değerlerine log₁₀ dönüşümü uygulandı ve 2, 4 ve 6. gün zaman noktaları kullanılarak eğimler hesaplandı. Ardından, replikasyon kapasite skorlarını oluşturmak için replikasyon eğimleri, WT MJ4'ün eğimine bölündü. Analiz içi değişkenliği azaltmak için aynı RT plakasından elde edilen MJ4 WT değerlerine göre normalizasyon yapmak önemlidir.

Tablo 1: Radyoetiketli ters transkriptaz deneyi ana karışım reçetesi.
NOT: -20 °C'de 1 ml'lik alikotlar halinde saklayınız.

Reaktif	Hacim (ml)
Nükleaz içermeyen H2O	419.5
Tris-Cl, pH 7.8 (1 M)	30
Potasyum klorür (1 M)	37.5
Magnezyum klorür (1 M)	2.5
Nonidet P-40 (10%)	5
EDTA (0.5 M)	1.02
Poliadenilik asit, potasyum tuzu (2 mg/ml)	1.25
Oligo-dT primeri (25 μg/ml)	3.25
Toplam hacim	500

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hücre Kültürü Reaktifleri
Amphyl temizleyici/dezenfektan	Fisher	22-030-394
Çok kanallı pipet için rezervuar tepsileri, 55 ml	Fisher	13-681-501
1 M Magnezyum klorür çözeltisi	Sigma-Aldrich	M1028-100ML
Reverse Transcriptase (RT) Kantitasyon Analiz Reaktifleri
dTTP, [α-³³P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi	Perkin-Elmer	NEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8.0	Life Technologies/Invitrogen	15568025	KOH ile pH 7,8'e ayarlanmalıdır
2 M Potasyum klorür (KCl)	Life Technologies/Invitrogen	AM9640G	1 M çözeltiye ayarlanmalıdır
0.5 M EDTA	Life Technologies/Invitrogen	15575-020
Nonidet P40	Roche	11333941103
Poliyadenilik asit (Poly rA) potasyum tuzu	Midland Reagent Co.	P-3001
Oligo d(T) primeri	Life Technologies/Invitrogen	18418-012
Ditiyotreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815-1G
SR, Süper Çözünürlüklü Fosfor Ekran, Küçük	Perkin-Elmer	7001485
Corning Costar Thermowell 96 kuyucuklu plaka modeli (M) Polikarbonat	Fisher	07-200-245	Corning Life tarafından üretilmiştir
Corning 96 kuyucuklu Mikroplaka Alüminyum Sızdırmazlık Bandı, Steril Olmayan	Fisher	07-200-684	Corning Life tarafından üretilmiştir
DE-81 anyon değişim kağıdı	Whatman	3658-915
Trisodyum sitrat dihidrat	Sigma-Aldrich	S1804-1KG
Sodyum Klorür	Fisher	S671-3
Otoradyografi kaseti	Fisher	FB-CA-810
Cyclone depolama fosfor ekranı	Packard
Termosikletör, PTC-200	MJ Research