Lusiferaz Tabanlı Viral Kantifikasyon için Numune Hazırlama

Özet

Kaynak: Garcia, V., et al. High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses. J. Vis. Exp. (91), e51890, doi:10.3791/51890 (2014).

Bu video, lusiferaz tabanlı bir analiz kullanarak viral yükün değerlendirilmesi için hücre kültürü örneklerinin hazırlanmasını göstermektedir. Epitel hücrelerin genetik olarak modifiye edilmiş bir virüsle enfekte edilmesi, viral süpernatanların ve standartların analiz kuyucuklarına aktarılması, ayrıca santrifüj ve inkübasyon yoluyla viral girişin teşvik edilmesi süreçleri ana hatlarıyla açıklanmaktadır. Lusiferaz ekspresyonu bir raporlayıcı olarak hizmet ederek, lüminesans sinyal çıktısına dayalı olarak viral konsantrasyonun kantifikasyonuna olanak tanır.

Protokol

1. Numune Hazırlama

1. Titrasyon için lusiferaz eksprese eden virüs içeren örnekleri (burada örnek olarak VSV∆51-Fluc) temin edin ve 96 kuyucuklu plakalara aktarın. Alternatif olarak, enfeksiyonları 96 kuyucuklu doku kültürü plaklarında gerçekleştirin ve süpernatantları doğrudan kullanın.
2. Standart eğrilerin eklenmesi için iki sütunu işlem görmemiş olarak bırakın. Doğrudan 96 kuyucuklu plakalarda yapılan deneyler için, deneyin sonunda (enfeksiyondan 40 saat sonra) titrasyon yapın veya -80 °C'de saklayıp daha sonraki bir tarihte titrasyonu gerçekleştirin.

2. Virüs Titrasyonu için Permisif Hücrelerin Hazırlanması

1. Titrasyondan 24 saat önce, %10 fetal bovine serum (FBS), 30 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) ve %1 penisilin/streptomisin içeren Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) içerisinde 2.5 x 10⁵ hücre/ml konsantrasyonunda bir Vero hücresi süspansiyonu hazırlayın. 
   NOT: Bu protokolde Vero hücreleri kullanılmış olsa da, veziküler stomatit virüsü (VSV) enfeksiyonu için uygun herhangi bir permissif hücre hattı kullanılabilir.
2. Bir mikroplaka dağıtıcı kullanarak 96 kuyucuklu beyaz, katı, düz tabanlı plakalara 2.5 x 10⁴ hücre (100 μl) ekleyin.
   1. Plaka başına 12 ml hücre süspansiyonu ve hazırlık (priming) için ek 5 ml hazırlayın.
   2. Hortumları 50 ml steril su ile yıkayarak mikroplaka dağıtıcı kaseti temizleyin.
   3. Mikroplaka dağıtıcı hatlarını hücre süspansiyonu ile doldurun ve 5 ml hücre süspansiyonunun akmasını sağlayın.
   4. Beyaz duvarlı 96 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna 100 μl dağıtacak bir program seçin. Dağıtımı gerçekleştirin ve gerekirse ek plakalar için işlemi tekrarlayın. Ayrıca, hücre sağlığı ve yoğunluğunun doğrulanması için opak tabanlı beyaz duvarlı plakalar kullanılıyorsa, 96 kuyucuklu şeffaf düz tabanlı bir plakada birkaç kuyucuğa ekim yapın.
   5. İşlem bittiğinde, hücreleri orijinal kaba geri boşaltın. Hortumlardan 50 ml %70 etanol ve ardından 50 ml ılık steril su geçirerek kaseti temizleyin.
   6. Kasetin ve hortumların kullanımlar arasında uygun şekilde temizlendiğinden emin olun.
3. Hücreleri nemlendirilmiş %5 CO₂ inkübatöründe 37 °C'de 24 saat inkübe edin.

3. Viral Standart Eğrisinin Hazırlanması

1. Vero hücrelerine aktarıldıktan sonra ml başına plak oluşturan birimlerin (pfu) nihai konsantrasyonu şu şekilde olacak şekilde serumsuz DMEM içinde bir VSV∆51-Fluc standart eğrisi hazırlayın: 10⁸ pfu/ml, 10⁷ pfu/ml, 10⁶ pfu/ml, 10⁵ pfu/ml, 10⁴ pfu/ml, 10³ pfu/ml, 10² pfu/ml ve 10¹ pfu/ml. Her bir Vero hücresi plakası için her konsantrasyondan 50 μl ve ek olarak %10 fazlasını hazırlayın.
   NOT: Mutlak kantifikasyona izin verecek bir standart eğrisi oluşturmak için lusiferaz virüs stokunun titresi klasik bir yöntemle değerlendirilmelidir. Aksi takdirde, viral titre seyrelme basamaklarına göre keyfi olarak belirlenerek kesin titre bilgisi olmadan göreli kantifikasyon gerçekleştirilebilir. Örneğin, standart eğrinin ilk seyreltmesi 10⁸ viral birim olarak belirlenebilir ve sonraki 1/10 seyreltme 10⁷ şeklinde devam edebilir. Bu bağlamda, mutlak kantifikasyon doğru olmayacağı için değerler, önceden belirlenmiş bir numuneye kıyasla kat değişimi (fold-change) olarak ifade edilmelidir.

4. Örnek Süpernatanlarının Permisif Hücrelere Aktarılması

1. Şeffaf tabanlı 96 kuyucuklu plakaya ekilen Vero hücrelerini ışık mikroskobu altında kontrol ederek tek katmanların en az %95 konfluen olduğundan emin olun.
2. Beyaz duvarlı plakalara ekilen Vero hücrelerinin üzerine 25 μl örnek süpernatanı aktarın. Standart eğriler için ayrılan 2 sütuna süpernatan aktarmayın. 
   NOT: Bu işlem, 96 kanallı bir sıvı aktarıcı kullanılarak tek bir plakadaki tüm kuyucuklar için eş zamanlı olarak yapılabilir.
3. 8 veya 12 kanallı çok kanallı bir pipet kullanarak, Adım 3'te hazırlanan standart eğrinin her dilüsyonundan 25 μl'yi belirlenen 2 sütundaki Vero hücrelerine ekleyin.
4. Plakaları oda sıcaklığında (RT) 430 x g'de 5 dk boyunca santrifüjleyin.
5. Nemlendirilmiş %5 CO₂ inkübatöründe 37 °C'de 5 saat boyunca inkübe edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dulbecco Modifiye Eagle Besiyeri (DMEM)	Corning	SH30243.01
Fetal sığır serumu	NorthBio Inc.	NBSF-701
Fosfat tamponlu salin	Corning	21-040-CV
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1	1 mM konsantrasyonda, pH 7.3 çözelti hazırlayın
96 kuyucuklu, katı beyaz düz tabanlı, polistiren TC işlem görmüş mikroplakalar	Corning	3917	Daha yüksek işlem kapasitesi için 384 kuyucuklu plakalar da kullanılabilir
Synergy Mx	BioTek	SMTBL	Monokromör mikroplaka okuyucu
Liquidator96	Mettler Toledo	LIQ-96-200	96 uçlu manuel pipetleme sistemi
Filtreli sterilize Liquidator96 LTS Uçları	Mettler Toledo	LQR-200F	Seçilen pipetlerle uyumlu her türlü steril filtrelenmiş uç uygundur
Microflo	BioTek	111-206-21	Hücreleri 96 kuyucuklu plakaya eklemek için kullanılır
Fluoroskan Ascent FL	Thermo Scientific	5210450	Mikroplaka florometresi