Lentivirüs ile Enfekte Edilmiş Fare Embriyonik Kök Hücrelerinin Üretilmesi

Özet

Kaynak: Chiarella, A. M. et. al., Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers. J. Vis. Exp. (2018)

Bu video, lentiviral transdüksiyon kullanılarak genetik olarak modifiye edilmiş fare embriyonik kök hücrelerinin oluşturulmasını göstermektedir. Lentiviral partiküller, stabil genomik entegrasyona ve transdükte hücrelerin seçilmesine olanak tanıyan bir antibiyotik direnç markörü iletir.

Protokol

1. Fare Embriyonik Kök Hücrelerinin (mESC) Lentivirüs ile Enfekte Edilmesi

1. Düşük pasajlı (pasaj 35'ten küçük), feeder-free uyumlu kromatin in vivo assay (CiA) mESC'leri; %20 ESC düzeyinde fetal sığır serumu (FBS), 10 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), 1x esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), Pen/Strep, 2-merkaptoetanol ve 1:500 lösemi inhibitör faktör (LIF) ile desteklenmiş yüksek glukozlu Dulbecco's Modified Eagle medyum (DMEM) baz medyumda, %5 CO₂ içeren 37 °C'lik bir inkübatörde büyütün.
   NOT: LIF, toplu olarak toplanan ve -80 °C'de dondurulan Lif-1C-alpha üreten Cos hücrelerinin (COS LIF) süpernatantından elde edilir.
   1. Hücreleri, 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içindeki %0,1 jelatin ile 1 - 3 saat ön inkübasyona tabi tutulmuş ve ardından 1x PBS ile yıkanmış plaklarda büyütün. Hücreleri günlük olarak besleyin ve yoğunluklarına bağlı olarak her 2 - 3 günde bir pasajlayın.
      NOT: Morfolojik olarak, embriyonik kök hücre (ES) kolonileri küçük, yuvarlak ve birbirlerinden ayrı olmalıdır.
2. Enfeksiyondan 1 gün önce mESC'leri 12 kuyucuklu plaka formatına (kuyucuk başına 100.000 hücre) pasajlayın.
   1. Hücreleri bir hemositometre ile sayın. 10 cm formatında büyütülen hücreler için eski medyumu aspire edin, 5 mL 1x PBS ekleyin, PBS'yi aspire edin ve 1 mL %0,25 tripsin ekleyin. Hücreleri 37 °C'de 8 dakika boyunca tripsin içinde inkübe edin; inkübasyonun ortasında hücreleri sallayın ve vurun. Bu adımın amacı, hücreleri tek hücre süspansiyonu haline getirmektir.
3. 15 cm'lik plaktaki 293T insan embriyonik böbrek (HEK) hücrelerinin medyumu değiştirildikten 48 saat sonra, süpernatantı uzaklaştırın ve 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
4. Hücre döküntülerini çöktürmek için süpernatantı 300 x g'de 5 dakika santrifüjleyin.
5. Süpernatantı 0,45-µm'lik bir membran üzerinden filtreleyin.
   NOT: Diğer bazı malzemeler virüsü tutabildiğinden ve verimi önemli ölçüde azaltabildiğinden, sürfaktan içermeyen selüloz asetat (SFCA) membranlar kullandığınızdan emin olun.
6. Virüsü, SW32 rotoruna sahip bir santrifüj kullanarak ultrasantrifüjasyon ile konsantre edin ve 4 °C'de 2,5 saat boyunca 20.000 rpm (~72.000 x g) hızda döndürün.
7. Virüs ultrasantrifüjasyon ile konsantre olurken, 12 kuyucuklu plaktaki CiA mESC'leri 5 µg/mL polybrene içeren taze ES medyumu ile işleme tabi tutun.
8. Virüs konsantrasyonu tamamlandığında, süpernatantı dikkatlice aspire edin ve virüs peletini 100 µL 1x PBS içinde süspanse edin (aşırı kabarcıklardan kaçının).
9. Virüsü ve 1x PBS'yi 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Virüsü tamamen süspanse etmek için tüpü 300 x g'de (veya en düşük ayarda) vorteksleyin/sallayın. Kabarcıkları gidermek için tüpü mini masaüstü santrifüjde 5 - 10 saniye döndürün.
10. 12 kuyucuklu plağın her bir kuyucuğuna 30 µL virüs ekleyin. Plağı dairesel hareketlerle sallayın ve ardından plağı 1.000 x g'de 20 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Eklenen virüs miktarı, taşıyıcı konstrükt boyutu ile ters orantılı olan viral titrasyona bağlı olarak değiştirilebilir.
    1. Alternatif olarak, virüsü sıvı azot ile şok dondurun ve -80 °C'de saklayın. Ancak virüsü dondurmak viral titrasyonu düşürecektir.
11. 12 kuyucuklu plağı tekrar 37 °C'lik inkübatöre yerleştirin ve ertesi sabah (~16 saat sonra) medyumu taze ES medyumu ile değiştirin.
12. Enfeksiyondan 48 saat sonra, uygun antibiyotiği (örneğin, 1,5 µg/mL puromisin, 10 µg/mL blastisidin vb.) ekleyerek viral plazmidi entegre eden hücreleri seçin. Medyumu günlük olarak değiştirin ve hücrelerin çoğunluğu yüzüyorsa/ölüyse hücreleri 1x PBS ile yıkayın. Seleksiyon medyumunu, hücrelerin üzerinde %5 CO₂ içeren 37 °C'lik bir inkübatörde 72 - 96 saat boyunca tutun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM	Corning	10-013CV
NEAA	Gibco	11140-050
HEPES (doku kültürü için)	Corning	25-060-Cl
FBS	Atlantic Biologicals	S11550	Kalite için ayrı lotlar test edilmiştir
Virüs santrifüj tüpleri	Beckman Coulter	344058
Virüs filtre membranı	Corning	431220
Polybrene	Santa Cruz Biotechnology	SC134220
%0,25 Trypsin	Gibco	25200-056	EDTA ile
%0,05 Trypsin	Gibco	25400-054	EDTA ile
Puromycin	InvivoGen	ant-pr
Ultrasantrifüj	Optima	XPN-80
SW-32 santrifüj rotoru	Beckman Coulter	14U4354
SW-32 Ti santrifüj kovaları	Beckman Coulter	130.2
LentiX 293 İnsan embriyonik böbrek hücreleri	Clontech	632180
PBS	Corning	46-013-CM
CiA:Oct4 mESC	G. Crabtree'nin nazik hediyesi
Lif-1C-alpha üreten Cos hücreleri	J. Wysocka'nın nazik hediyesi