Metabolik ve Floresan Seçim Kullanılarak Rekombinant Vaccinia Virüsü Enfekte Hücrelerin Tanımlanması

Özet

Kaynak: Marzook, N. B., et al., Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins. J. Vis. Exp. (2014)

Bu video, enfekte epitelyal hücrelerde plazmit aracılı homolog rekombinasyon kullanılarak rekombinant vaccinia virüslerinin üretilmesini göstermektedir. Floresan ve metabolik belirteçler, etiketli proteinleri eksprese eden virüslerin seçilmesini ve tanımlanmasını sağlar.

Protokol

Rekombinant Virüs Üretimi

1. uyarınca Şekil 1, BS-C-1 [Buffalo Subclone C-1 (CV-1 hücrelerinden türetilmiş bir maymun böbrek epitel hücre hattı)] hücrelerini, serumsuz ortamda bir Enfeksiyon Çokluğu (MOI) ile vaccinia virüsü ile > 1.
2. Enfeksiyondan 1 saat sonra, hücreleri dulbecco's modified eagle medium (DMEM) ile kurtarın ve serumsuz ortamda, 3:1 oranında rekombinasyon vektör plazmidi ve transfeksiyon reaktifi karışımı ile transfekte edin.
3. 24 saat sonra, hücreleri fetal bovin serum (FBS) içermeyen DMEM içerisinde kazıyarak toplayın ve hücreleri parçalayıp virüs partiküllerini serbest bırakmak için üç kez dondurma-çözme döngüsü uygulayın.
4. %10 FBS içeren DMEM'den oluşan bir sıvı örtü ve GPT (Guanine Fosforiboziltransferaz (E. coli kaynaklı)) ile bir plak testi gerçekleştirin: E. coli) seçilim reaktifleri, mikofenolik asit (25 µg/ml), ve ksantin (250 µg/mlşu şekilde gerçekleştirilir:
   1. 6 kuyucuklu bir plakaya BS-C-1 hücrelerinden oluşan bir monolayer ekleyin.
   2. Tekil plakların yeterince ayrışmasını sağlamak amacıyla, %100 konfluens düzeyine ulaşmış hücre monokatmanlarını, virüs partikülleri içeren dondurulup çözülmüş hücrelerin seri dilüsyonalı ile enfekte edin.
   3. GPT seçici reaktiflerini -sırasıyla 25 µg/ml ve 250 µg/ml nihai konsantrasyonlarda mikofenolik asit ve ksantin- içeren %10 FBS'li sıvı DMEM ile kaplayın. 25 µg/ml ve 250 µg/mlsırasıyla.
5. 24 saatlik inkübasyonun ardından sıvı örtüyü kaldırın ve mCherry'nin TDS (geçici dominant seleksiyon) vektöründen virüse entegrasyonuna karşılık gelen yaygın kırmızı floresans gösteren plakları aramak için bir floresan mikroskobu kullanın. Hedef gene ve seçilen floresan etikete bağlı olarak, aynı kırmızı plak içinde etiketli genin lokalize floresansı da gözlemlenebilir.
6. Her bir rekombinant virüs için, bir pipet ucuyla lokal kazıma yaparak birden fazla plak seçin ve 100 µl hücreleri bir Eppendorf tüpüne aktarmak için %5 FBS içeren DMEM kullanın ve ardından rekombinant virüsleri salmak için kazınmış hücrelere üç tur dondurma-çözme işlemi uygulayın.
7. Dondurulup çözülmüş virüs içeren DMEM'i, büyüme ortamındaki GPT seleksiyon re ajanları ile rekombinant virüsleri amplifiye etmek için 12 kuyucuklu bir plaktaki hücre monotabakasına ekleyin. Başarılı amplifikasyonları enfeksiyondan 24 saat sonra kazıyarak toplayın.
8. Kırmızı floresans sergileyen ve başarıyla amplifiye edilmiş plakların plak analizini, bu kez bir agaroz kaplama ve GPT seçimi ile şu şekilde gerçekleştirin:
   1. 6 kuyucuklu bir plakada BS-C-1 hücrelerinden tek tabaka oluşturun.
   2. Rekombinant virüslerin seri dilüsyonunu gerçekleştirin ve kuyucukları, FBS içermeyen DMEM içerisindeki artan dilüsyondaki virüslerle enfekte edin.
   3. Enfeksiyondan 1 saat sonra, sıvı besiyerini uzaklaştırın ve her kuyuğun üzerini %2,5 FBS içeren minimal esansiyel besiyeri (MEM) içindeki %0,5'lik agaroz ile kaplayın, 292 µg/ml L-glutamin, 100 U/ml penisilin ve 100 µg/ml streptomisin ve GPT seleksiyon reaktifleri ile birlikte.
9. Enfeksiyondan 2-3 gün sonra, bu kez GPT seçimi olmadan yeniden amplifiye etmek için hem kırmızı hem de seçilen floresan etiketin renginde floresans gösteren plakları seçin.
10. Bir sonraki plak analizini, seleksiyon uygulamadan agaroz kaplama ile gerçekleştirin.
11. Yaygın kırmızı floresan özelliklerini kaybetmiş ancak seçilen etikete karşılık gelen lokalize floresan özelliklerini koruyan plakları seçin.
12. mCherry ve gpt seleksiyon genlerini kaybeden ancak seçilen etikete karşılık gelen lokalize floresans özelliğini koruyan rekombinant virüslerin saf bir stokunu elde etmek için seleksiyon yapmadan plak saflaştırmaya devam edin. Stokların saf olduğunu plak analizi ile kontrol edin; tüm plaklar benzer bir plak fenotipine sahip olmalıdır.

Sonuçlar

Şekil 1. Rekombinant bir vaccinia virüsü oluşturmaya yönelik deneysel prosedürün taslağı. Genetik ve hücresel düzeyde meydana gelen olaylar, A3-GFP etiketli floresan bir vaccinia virüsünün oluşturulmasını takip eden adımları özetleyen temsili plak görüntüleriyle birlikte gösterilmiştir. (A) Vaccinia virüsü ile enfekte edilen hücreler, TDS rekombinasyon vektörü ile transfekte edilir. (B) Bu şekilde yalnızca sol taraf rekombinasyonunun sonucu gösterilmiştir ve örnekte seçilen floresan etiket olarak GFP kullanılmıştır. Sağ taraf rekombinasyonu, TDS plazmidinin tamamının benzer şekilde genoma entegre olmasıyla sonuçlanacaktır; ancak ara basamakta etiket, hedef genin tamamına füze edilecektir, yani, adım C. Bir hücre monokatmanı üzerinde rekombinasyon karışımı ile bir plak deneyi gerçekleştirilir ve GPT seçimine tabi tutulur. (C) Sırasıyla mCherry ve GFP ekspresyonuna karşılık gelen hem kırmızı hem de yeşil floresans sergileyen plaklar seçilir ve amplifiye edilir. Seleksiyon kaldırıldığında, şunların kaybına karşılık gelen kırmızı floresans kaybı meydana gelecektir: gpt ve mCherry genler (D), ve sadece yeşil floresans gösteren plaklar seçilip amplifiye edilir (E).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mikofenolik asit	Sigma-Aldrich	M3536-50MG	0.1 N NaOH içinde çözün
Ksantin	Sigma-Aldrich	X0626-5G	0.1 N NaoH içinde çözün
FuGENE HD transfeksiyon reaktifi	Promega	E2311
31001, 31002 Chroma filtreli floresan mikroskobu	Olympus, Chroma	BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)