Kanser Hücrelerinde Kombine Adenoviral Transdüksiyon ve siRNA Aracılı Nakavt

Özet

Kaynak: Fuchs, M. et al. Adenofeksiyon: Eksiltme-Kurtarma Deneyleri ile Hücresel Morfodinamikte Moleküler Şaperonların Rolünü İncelemek İçin Bir Yöntem. J. Vis. Exp. (2016)

Bu video, serviks kanseri hücrelerinde siRNA-kalsiyum fosfat transfeksiyonu ile kombine edilmiş, adenovirüs aracılı floresan bir transgen iletimini göstermektedir. Adenovirüs floresan bir yer değiştirme proteini ekspres ederken, siRNA RISC bağlanması yoluyla hedeflenmiş mRNA degradasyonunu indükler. Bu ardışık ko-transfeksiyon, endojen proteinin eş zamanlı knockdown'ını ve transgen tarafından fonksiyonel kurtarmayı (rescue) mümkün kılarak, protein yer değiştirmenin floresan görüntüleme yoluyla görselleştirilmesine ve doğrulanmasına olanak tanır.

Protokol

1. Kalsiyum Fosfat (CaPi) Presipitatleri Kullanılarak HeLa-RFP-H2B Hücrelerinde Adenovirüs Transdüksiyonu ve Küçük İnterferan RNA (siRNA) Transfeksiyonu ile Endojen Proteinin Nakavt Edilmesi

NOT: İlgi duyulan geni taşıyan rekombinant adenovirüsün en düşük miktarı kullanılarak, tüm Adenofeksiyonlarda minimum bir enfeksiyon çokluğuyla (MOI) (hücre başına 10-20 plak oluşturan birim (PFU)) ulaşmak için, ilgisiz bir gen (örneğin LacZ) taşıyan veya hiç gen taşımayan bir kontrol adenovirüsü kullanılır.

NOT: Bu prosedürün, geniş bir hücre popülasyonunda hücre başına düşen ekspresyonun normalleştirilmesine yardımcı olduğu gösterilmiştir.

1. Hücre ekiminden bir gün sonra, ek olarak ekilen kaptaki hücre sayısını sayın. Besiyerini aspire edin ve 1 mL %0,05 Trypsin/etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile bir kez durulayın. Tekrar 1 mL %0,05 Trypsin/EDTA ekleyin ve tüm hücreler ayrılana kadar 37 °C, %5 CO₂'de inkübe edin. Hücreleri 1 mL'lik bir pipet kullanarak iyice ayırın ve bir hemositometre kullanarak mL başına düşen hücre sayısını sayın.
2. Hücre başına 2 PFU hedef protein (POI) ve hücre başına 18 PFU boş vektör (örneğin, LacZ) olmak üzere toplam hücre başına 20 PFU şeklinde hücreleri transduse etmek için gereken virüs miktarını belirleyin. Aynı zamanda, yeşil floresan protein (GFP)-etiketli aktin ve kırmızı floresan protein (RFP)-etiketli α-tübulin kodlayan her bir bakulovirüsten 4 PFU transduse edin. Hücreleri aşağıdaki adenofeksiyon protokolünü kullanarak transduse edin.
3. Steril bir kabinde her koşul için 1,5 mL'lik bir plastik tüp hazırlayın ve 400 μL ılık alfa minimum esansiyel besiyeri (αMEM) ekleyin.
4. Virüslerden bir alikotu buz üzerinde yavaşça çözün ve pipetleme hatalarını en aza indirmek için 1 μL'den daha büyük bir hacim pipetlemek amacıyla gerekirse virüs stokunu seyreltin.
5. Her koşul için hesaplanan virüs miktarını 400 μL αMEM içeren her bir 1,5 mL'lik plastik tüpe ekleyin ve pipetleyerek nazikçe karıştırın. Aktivitesini korumak için virüs stokunu hemen -80 °C'ye geri koyun.
6. Hücrelerdeki besiyerini aspire edin ve virüs karışımını damla damla nazikçe pipetleyin. Hücrelerin virüsle iyice kaplandığından emin olmak için hücreleri 37 °C, %5 CO₂'de inkübe edin ve steril kabin altında her 15 dakikada bir 1 saat boyunca plakaları dikkatlice çalkalayın. Az miktarda besiyeri kullanmak, virüsün hücrelerle temasını kolaylaştırır.
7. İnkübasyondan sonra, toplam 2 mL hacim elde etmek için her plakaya nazikçe 1,6 mL αMEM pipetleyin, 2 mM timidini ekleyerek hücre senkronizasyonunu başlatın ve hücreleri 37 °C, %5 CO₂'de 2 saat daha inkübe edin.
8. Bu sırada, CaPi transfeksiyon yöntemini izleyerek siRNA transfeksiyon karışımını hazırlayın (bkz. Şekil 1). siRNA gerekli değilse, boş bir transfeksiyon gerçekleştirmek için siRNA miktarını steril su ile değiştirin.
9. Her koşul için 200 μL karışım hesaplayın, bu da duble başına 400 μL ile sonuçlanır. Aşağıdaki örnek 50 nM nihai siRNA konsantrasyonu için verilmiştir ve her bir hedef proteine göre uyarlanmalıdır. 1,5 mL'lik bir plastik tüpe, 139 μL steril H₂O içine 50 μL 1 M CaCl₂ ve 11 μL 20 μM siRNA pipetleyin ve vorteksleyerek karıştırın. Kısa bir santrifüj sonrası, 200 μL 2× HEPES-tamponlu salin (HBS2x) (280 mM NaCl, 50 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), 1,5 mM Na₂HPO₄, pH 7,01-7,05) damla damla dikkatlice ekleyin.
   NOT: Damlalar ne kadar küçük olursa, çökelekler o kadar küçük olur ve bu da daha iyi transfeksiyon verimliliği ile sonuçlanır. 200 μL'lik bir pipet kullanarak hava enjeksiyonu ile üç kez nazikçe karıştırın.
10. Karışımı oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe edin. Her plakaya 200 μL transfeksiyon karışımını yavaşça ekleyin ve çaprazlama çalkalayın. Plakaları 16 saat boyunca 37 °C, %5 CO₂'ye transfer edin.
11. Ertesi gün, hücreleri 2 mL ılık HEPES (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,3) ile iki kez durulayın ve 2 mL αMEM ekleyin. Sıcaklık varyasyonları hücre döngüsü süresini etkilediği için aynı anda dört hücre plağından fazlasıyla devam etmeyin.
12. Enfeksiyon verimliliğini, ters floresan mikroskobu altında 20-40x (hava) büyütmede görselleştirin ve dokümantasyon için her koşul başına hem floresan hem de transmisyon kanallarında üç temsili görüntü edinin. Yedi saat sonra, 2 mM timidini ekleyin ve 37 °C, %5 CO₂'de 16 saat daha inkübe edin.
13. Ertesi gün, siRNA transfeksiyonu ve virüs enfeksiyonundan 48 saat sonra, hücreleri 2 mL ılık fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez durulayın ve canlı hücre görüntüleme için Fenol Kırmızı içermeyen 2 mL αMEM'de veya protein ekstraksiyonu için Fenol Kırmızı içeren 2 mL αMEM'de 7 saat boyunca serbest bırakın.
14. Knockdown verimliliğini ve endojen protein ekspresyonunu belirlemek amacıyla protein ekstraktlarının hazırlanması ve Western blot analizi için her koşuldaki hücreleri transfeksiyondan 48 saat sonra hasat edin.
    NOT: Hedef proteine karşı antikorların yanı sıra yükleme kontrolü olarak hizmet eden uygun antikorlar kullanın. Knockdown verimliliği, bir titrasyon eğrisi (örneğin, 1, ½, ¼, ⅛) sağlamak için azalan miktarlarda kontrol hücre lizatlarının (kontrol siRNA ile transfekte edilmiş) yüklenmesiyle belirlenmelidir.

Sonuçlar

Şekil 1. Tipik bir adenofeksiyon protokolünün planlanması. CaPi çökelekleri kullanan protokol (gri ile altı çizili) veya katyonik bir lipid transfeksiyon reaktifi kullanan protokol (sarı ile vurgulanmış) için hücre ekimi, adeno- ve bakulovirlerin transduksiyonu, siRNA duplekslerinin transfeksiyonu ve çift timidin blok ile hücre senkronizasyonu dahil olmak üzere tipik bir deneyin ardışık adımları gösterilmiştir. Her iki protokol için saat cinsinden zaman çizelgeleri şeklin sağ tarafında gösterilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
EDTA	Sigma	E5134
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronektin	Sigma	F1141
Cam tabanlı kaplar, 35 mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Dr Sabine Elowe'nin nazik hediyesi, Québec, Kanada
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamin	Thermo Fisher	25030081
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha	Wisent	310-101-CL
Deoksiribonükleosit/Ribonükleosit içermeyen Minimal Essential Medium (MEM) Alpha	Thermo Fisher	12000-022
Fenol Kırmızısı içermeyen Minimal Essential Medium (MEM) Alpha	Thermo Fisher	41061-029
Na₂HPO₄	Biobasic	S0404
Özel tasarım Adenovirüs	Welgen	Custom design
Kalsiyum Klorür	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
siRNA dupleksleri	Dharmacon	Custom design
Timidin	Sigma	T9250
Tripsin %2,5	Thermo Fisher	15090-046