Mühendislik Yöntemleriyle Hazırlanmış Virüs Benzeri Partiküllerde Yüzeye Erişilebilir Sistein Kalıntılarının Etiketlenmesi

Özet

Kaynak: Natilla, A.,and Hammond, R. W. Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs. J. Vis. Exp. (2013)

Bu video, bir tiyol-reaktif boya kullanılarak Nicotiana benthamiana bitkisinde üretilen mutant virüs benzeri partiküllerin (VLP'lerin) bölgeye özgü floresan işaretlenmesini, ardından yüzey modifikasyonunu doğrulamak için gerçekleştirilen saflaştırma ve jel elektroforez işlemlerini göstermektedir.

Protokol

1. Nicotiana benthamiana Bitkilerinden Virüs İnokülasyonu ve VLP'lerin Purifikasyonu

1. Ambion's T7-mMessage mMachine Kit kullanarak, Maize rayado fino virus (MRFV) yabani tip (wt) ve Sistein-mutasyonlu kılıf proteini (CP) genlerini taşıyan Potato virus X (PVX) tabanlı vektör plazmidlerinden başlığı kapatılmış T7-RNA transkriptleri üretin.
2. Her bir T7 transkript reaksiyonu için, N. benthamiana'nın iki tam gelişmiş yaprağını 10 μL reaksiyon karışımı ile inoküle edin ve bitkileri serada, %60 nemde, 16 saat ışık (25.000-30.000 lüx) 25 °C ve 8 saat karanlık 20 °C koşullarında 10 gün boyunca inkübe edin.
3. İnokülasyondan 10 gün sonra (dpi), virüsle enfekte olmuş N. benthamiana yapraklarını hasat edin, bitki dokusunu tartın (50 gram) ve buz üzerine yerleştirin.
4. Bitki materyalini, 100 mL soğutulmuş 0.5 M Na-Sitrata tamponu, pH 5.5 varlığında bir blenderda homojenize edin (gram başına 2 mL tampon kullanın).
5. Homojenatı 3 kat tülbentten süzün ve 27.000 × g'de 30 dakika santrifüj ederek berraklaştırın. Süpernatantı soğutulmuş dereceli bir silindire aktarın, hacmini ölçün ve ardından soğutulmuş steril bir behere aktarın. Peleti atın.
6. Süpernatantı %10 polietilen glikol 8.000 (PEG 8.000) ekleyerek işleyin, 4 °C'de 15 dakika karıştırın ve virüs benzeri parçacıklar (VLP'ler)-PEG matrisini çöktürmek için 4 °C'de 45 dakika daha inkübe edin.
7. Numuneyi 4 °C'de 27.000 × g'de 20 dakika santrifüj edin ve süpernatantı uzaklaştırın.
8. Peleti, %2 Triton X-100 içeren 8 mL 0.05 M Na-Sitrata tamponu, pH 5.5 ekleyerek işleyin. Peletin serbest kalması için santrifüj tüplerini iyice çalkalayın. Peleti ve tamponu soğutulmuş steril bir behere aktarın. Tüpleri hemen 2 mL aynı tamponla durulayın ve behere ekleyin. Süspansiyonu, peletler çözülene kadar 4 °C'de karıştırın (genellikle 1 saat).
9. 27.000 × g'de 5 dakika santrifüj ederek berraklaştırın, peleti atın ve süpernatantı 4 °C'de 140.000 × g'de 2 saat santrifüj ederek işleyin.
10. Peleti 1 mL 0.05 M Na-Sitrata tamponu, pH 5.5 içinde yeniden süspande edin ve süspansiyonu 0.05 M Na-Sitrata tamponu, pH 5.5 ile hazırlanmış %10-40'lık sükroz gradyanının üzerine yerleştirin.
11. Gradyanı 4 °C'de 140.000 × g'de 3 saat santrifüj edin.
12. Santrifüj tüpünün üst kısmına ışık tutun ve tüpün üstünden 4 cm mesafedeki ışığı dağıtan üst bandı toplayın, 0.05 M Na-Sitrata tamponu, pH 5.5 ile seyreltin ve 4 °C'de 140.000 × g'de 3 saat santrifüj edin.
13. Peleti 0.5 mL steril su içinde yeniden süspande edin ve 4 °C'de altı aya kadar saklayın.
14. Bradford protein analizi gerçekleştirerek VLP konsantrasyonunu belirleyin. VLP verimi, gram bitki dokusu başına 1 ile 3 μg arasındadır.

2. VLP'lerin floresein-5-maleimid ile işaretleme reaksiyonları

1. 50 mM sodyum fosfat tamponu, pH 7.0; 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içerisinde 1 mM'lık fluorescein-5-maleimid (427.37 g/mol) çözeltisi hazırlayın. Vorteks kullanarak karıştırın ve tamamen çözündüğünden emin olun. Tüpü alüminyum folyo ile ışıktan koruyun.
2. 1. adımda üretilen VLP'lere fluorescein-5-maleimid ekleyin ve karıştırın. Sülfhidril molar miktarı için 25 kat molar fazlalıkta fluorescein-5-maleimid kullanın. Genellikle, 1 μg/μL konsantrasyonunda 30 μL VLP ve 60 μL fluorescein-5-maleimid çözeltisi kullanmak kabul edilebilir sonuçlar verir.
3. Reaksiyonu oda sıcaklığında 2 saat veya 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.
4. Final konsantrasyonu 50 mM olacak şekilde ditiyotreitol (DTT) ekleyerek reaksiyonu sonlandırın.
5. Reaksiyona girmemiş fluoresceini, bir tuz giderme spin kolonu (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) ve oda sıcaklığında 1.500 × g'de 2 dakika santrifüj ederek uzaklaştırın.
6. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) analizi için, her reaksiyondan 10 μL'ye 10 μL 2 × SDS-PAGE Laemmli örnek tamponu ekleyin. Etiketli proteini ışıktan koruyarak 4 °C'de bir aya kadar veya tek kullanımlık alikotlar halinde -20 °C'de 3 aya kadar saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
İnce Duvarlı, Ultra Berrak Tüpler	Beckman	344059
mMESSAGE mMACHINE T7 Kiti	Life Tecnologies	AM1344M
Fluorescein-5-Maleimide	Thermo Scientific Life Technologies	46130 F150	46130 tedarik dışıdır, yerine F150 kullanın
Laemmli Tamponu	Bio-Rad	1610737
Tris Glisin SDS (Sodyum Dodesil Sülfat) Çalıştırma Tamponu	Invitrogen	LC2675
Tris Glisin Transfer Tamponu	Invitrogen	LC3675
Nitrocellulose Membran Filtre Kağıdı Sandviç	Invitrogen	LC2001
EZ-Link Maleimide-Polietilen Glikol (PEG) 2-Biotin, Tartı Gerektirmeyen Format	Thermo Scientific	21901