Konak İmmün Yanıtlarını Değerlendirmek Amacıyla Farelerde İntranazal Murine Herpesvirüs Enfeksiyonu

Özet

Kaynak: Zhang, J., et al. P. Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production. J. Vis. Exp. (2014)

Bu video, akciğere özgü bir bağışıklık yanıtı oluşturmak amacıyla farelere murine herpesvirusun intranazal olarak uygulanmasını göstermektedir. Konak bağışıklık yanıtlarının daha sonraki değerlendirmeleri için, sitokin içeren süpernatanlar elde etmek amacıyla akciğer dokusu işlenmektedir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. γHV68 Enfekte Farelerde ELISA ile Sitokin Salınımı

1. Cinsiyeti eşleştirilmiş, 6-8 haftalık C57BL/6 (B6) kardeş fareleri (grup başına 8-12 fare), intraperitonal yolla 1.5 mg ketamin/0.12 mg ksilazin enjekte ederek anesteziye alın ve 40 µl hacmindeki 40 PFU (Plak oluşturan birim) γHV68 ile intranazal olarak inoküle edin. Enfeksiyon sonrası farklı zaman noktalarında fareleri, CO₂ inhalasyonu ve ardından servikal dislokasyon uygulayarak ötanize edin.
2. Göğüs kafesini sternum boyunca sol lateral bir kesi ile açın ve kaburgaları keskin bir makasla kesin. Akciğer dokularını toplayın.
3. Akciğer dokusunun yarısını (sol lob), 500 µl 1.0 mm Zirkonya/Silika boncuk içeren steril 1.5 ml vidalı kapaklı tüplere toplayın. Tüpe 1 ml soğuk serumsuz DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) ekleyin ve akciğer dokusunu 30 saniye boyunca boncuk çırpma (bead-beating) yöntemiyle homojenize edin. Tüpleri 2 dakika boyunca buz üzerinde soğutun ve bu işlemi bir kez tekrarlayın.
4. Tüpleri 4 °C'de santrifüjleyin (10 dakika boyunca 15,000 x g), süpernatantı toplayın ve sitokin üretimini aşağıda açıklandığı şekilde ölçün.
5. Üretici talimatlarına uygun olarak, ticari olarak mevcut sitokin ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) kitlerini kullanarak sitokinleri ölçün.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fare CCL5 ELISA kiti	R&D Systems	DY478
1.0 mm Zirkonya/Silika boncuklar	BioSpec Products	11079110z