Mühendislik ürünü E. coli içinde Virüs Benzeri Partiküllerin Üretimi

Özet

Kaynak: Chen, Z., et al. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (2018)

Bu video, mühendislik ürünü E. coli hücrelerinde bakteriyofaj Qβ kapsid proteininin kontrollü ekspresyonu yöntemini göstermektedir. Elde edilen proteinler, daha sonraki biyokonjugasyon işlemleri için hasat edilen virüs benzeri parçacıklar oluşturacak şekilde kendiliğinden birleşir.

Protokol

Qβ Ekspresyonu

1. Tezgah alanını 1:1 çamaşır suyu/etanol ile silin.
2. Aseptik bir ortamda, tekil E. coli BL21(DE3) kolonilerini 3 mL Super Optimal Broth (SOB) besiyerine ekleyerek iki adet 3 mL'lik başlangıç kültürü hazırlayın.
3. 37 °C ve %0 bağıl nemli (rH) bir odada, çalkalayıcıda 250 rpm'de gece boyunca büyütün.
4. Başlangıç kültürünü SOB besiyerine inoküle edin:
   1. Her iki 3 mL'lik başlangıç kültürünü çalkalayıcıdan alın ve aseptik bir ortamda, her birini içinde 1 L taze SOB besiyeri bulunan iki adet 2 L'lik bölmeli Erlenmeyer balonundan birine dökün.
   2. İnoküle edilmiş besiyerini 37 °C ve %0 rH'lik bir odada, çalkalayıcıda 250 rpm'de tutun.
5. Bakterileri 37 °C ve %0 rH'lik bir odada, çalkalayıcıda 250 rpm'de OD₆₀₀ değeri 0,9–1,0'a ulaşana kadar büyütün.
6. Protein ekspresini indüklemek için P1000 pipet kullanarak 1 mL 1 M izopropil β-D-1 tiyogalaktopiranosit (IPTG) ekleyin.
7. Besiyerini 37 °C ve %0 rH'lik bir odada, çalkalayıcıda 250 rpm'de gece boyunca bırakın.
8. Ertesi sabah besiyerini çalkalayıcıdan çıkarın ve hücreleri toplamak için 1000 mL'lik şişeler kullanarak 4 °C'de 1 saat boyunca 20,621 × g'de santrifüjleyin.
9. Süpernatantı dökün ve hücre peletini toplayın.
   1. Bakterileri öldürmek için süpernatantı içinde yaklaşık 5 mL çamaşır suyu bulunan bir balona dökün. Bu bir atıktır.
   2. Bir spatula kullanarak hücre peletini santrifüj şişesinin dibinden kazıyın ve peleti 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
LB Broth (Miller)	EMD Millipore	1.10285.0500
Tripton, Toz	Research Products International	T60060-1000.0
Maya Ekstraktı, Toz	Research Products International	Y20020-1000.0
Susuz magnezyum sülfat	P212121	CI-06808-1KG
Sodyum Klorür (Kristal/Sertifikalı ACS)	Fisher Scientific	S271-10
Potasyum Klorür	Fisher Scientific	BP366-500
Elga PURELAB Flex 3 Su Saflaştırma Sistemi	Fisher Scientific	4474524
Potasyum Fosfat Monobazik	Fisher Scientific	BP362-1
Potasyum Fosfat Dibazik Susuz	Fisher Scientific	P288-500
İzopropil β-D-1-tiogalaktopiranozid (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-1G
Kapaklı Nalgene Santrifüj Şişeleri, Polipropilen Kopolimer	Thermo Scientific	3141-0250
VWR Os-500 Orbital Çalkalayıcı	VWR Scientifc Products	14005-830
P1000 Pipetman	Gilson	F123602
Falcon 50 mL Konik Santrifüj Tüpü	Fisher Scientific	14-432-22