Disülfür Yeniden Köprüleme Yoluyla Virüs Benzeri Partiküllerin Floresan Fonksiyonelleştirilmesi

Özet

Kaynak: Chen, Z., et al. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (2018)

Bu video, indirgenmiş disülfitlerin bir polietilen glikol (PEG) bağlayıcı ile yeniden köprülenmesi yoluyla virüs benzeri parçacıkların floresan fonksiyonelleştirmesini göstererek, biyomedikal uygulamalarda hücresel görüntüleme ve hedeflenmiş iletim için uygun, kararlı ve izlenebilir konjugatlar üretmektedir.

Protokol

1. Bakteriyofaj Qβ Üzerinde Dibromomaleimid (DB) Bileşiklerinin Konjugasyonu

1. Qβ üzerindeki disülfitlerin indirgenmesi.
   1. 100x stok çözelti hazırlamak için 0,0020 g tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP)'i 1 mL ultrapure su içinde çözün.
      NOT: İndirgeme işleminden önce taze TCEP hazırlayın.
   2. Bir mikrosantrifüj tüpüne 200 µL Qβ (5 mg/mL) ekleyin.
   3. Ardından 20 µL 100x TCEP stok çözeltisi ekleyin.
   4. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
2. İndirgenmiş disülfitlerin dibromomaleimid polietilen glikol (DB-PEG) kullanılarak yeniden köprülenmesi.
   1. 0,0017 g dibromomaleimid-polietilen glikolü (DB-PEG) 100 µL DMF içinde çözün.
   2. 680 µL 10 mM sodyum fosfat çözeltisi (pH 5) ekleyin.
   3. İndirgenmiş Qβ'yi DB-PEG çözeltisine ekleyin ve karıştırma işlemini 365 nm UV (ultraviyole) lamba altında gözlemleyin. Parlak sarı floresans, karıştırma üzerine 365 nm el tipi UV lamba ile hemen görselleştirilebilir.
   4. Reaksiyonun oda sıcaklığında (RT) rotasyonel karıştırıcıda gece boyunca sürmesini sağlayın.
3. Reaksiyon karışımını, 1x PBS (fosfat tamponlu salin) kullanarak 4 °C'de 20 dakika boyunca 3.283 x g'de, santrifüj filtresi (moleküler ağırlık kesme sınırı (MWCO) = 10 kDa) ile üç kez saflaştırın.
4. Konjugasyonu, indirgemeyen SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi) ve nativ agaroz jel elektroforezi ile izleyin.
   NOT: VLP'ler (virüs benzeri partiküller) nativ agaroz jelde bütün partiküller olarak ilerler ve yüklerine, boyutlarına ve şekillerine göre ayrılırlar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2,3-Dibromomaleimid %97	Sigma Aldrich	553603-5G
Polietilen glikol	Alfa Aesar	41561-22
Sodyum fosfat	Fisher Scientific	AC424375000
Akrilamid/bis-akrilamid	P212121	RP-A11310-500.0
Sodyum dodesil sülfat	Sigma Aldrich	L3771-100G
Amonyum persülfat	Fisher Scientific	BP179-100
Amicon Ultra-4 santrifüj filtre üniteleri	Millipore Sigma	UFC801024
Falcon 15 mL konik santrifüj tüpü	Fisher Scientific	14-959-53A
Mikrosantrifüj tüpü: 1,5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
VWR Os-500 orbital çalkalayıcı	VWR Scientifc Products	14005-830
P1000 Pipetman	Gilson	F123602
P200 Pipetman	Gilson	F123601
P100 Pipetman	Gilson	F123615
P20 Pipetman	Gilson	F123600
P10 Pipetman	Gilson	F144802
Intel Weighing PM-100 klasik yüksek hassasiyetli laboratuvar terazisi	Intelligent Weighting Technology	IWT_PM100