Transmisyon Elektron Mikroskobisi için Güvenli Viral Örnek Hazırlama

Özet

Kaynak: Blancett, C. D., et al. Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment. J. Vis. Exp. (2017).

Bu video, transmisyon elektron mikroskopisi için güvenli viral numune hazırlama işlemini göstermektedir. Viral partiküller glutaraldehit ile fikse edilir, elektron yoğun bir ajanla boyanır ve yapıları stabilize etmek ve tam inaktivasyonu sağlamak amacıyla osmiyum tetroksit ile buhar fiksasyonuna tabi tutulur; böylece yüksek kaliteli TEM görüntüleme için kontrast artırılırken viral numunelerin güvenli bir şekilde taşınması sağlanır.

Protokol

1. Sulu Glutaraldehit ve %1 Ozmiyum Tetroksit Buharı İnaktivasyonu Kullanılarak Biyogüvenlik Alanında Negatif Boyama için Kapsül Yöntemi

1. Biyogüvenlik kabini (BSC) içerisinde, bir pipete takılı olan kapsüle 40 µL virüs süspansiyonu çekin.
   NOT: İşlem tamamlanana kadar pipet kapsüle takılı kalır.
2. Izgaralar yatay konumda olacak şekilde pipeti 10 dk boyunca yan yatırın. Bu, virüs partiküllerinin kaplanmış ızgaralar üzerine eşit dağılımını sağlamak içindir.
3. Kapsül içindeki virüsü biyogüvenlik kabini içerisinde inaktive edin.
   1. Pipeti kaldırın ve virüs çözeltisini bir atık konteynerine boşaltmak için pistonu bastırın.
   2. Kapsüllere 40 µL %2 glutaraldehit tespit edici çekin. Dikkat: Glutaraldehit tehlikeli bir kimyasaldır ve uygun koruma gerektirir. Glutaraldehit normal bir BSC'de kısa süreler için kullanılabilir, ancak reaktifin uzun süre açık kalması durumunda kanallı bir BSC veya kimyasal çeker ocak kullanılması gerekir.
   3. Pipeti 20 dk boyunca yan yatırın. Bu, örneklerin iyi tespit edildiğinden emin olmak içindir.
   4. Tespit ediciyi boşaltın ve tespit ediciyi yıkamak için kapsüllere 40 µL DI (deiyonize) su çekin. Bu yıkama adımını toplam 3 durulama döngüsü boyunca tekrarlayın.
4. Kapsüllere 40 µL %1 uranil asetat (UA) veya %1 potasyum fosfotungstik asit (PTA) çekin ve 30 s bekletin.
   NOT: Boyama süresi, virüs örneğine bağlı olarak 10 s ile 1 dk arasında değişebilir.
   DİKKAT:: UA bir alfa yayıcıdır ve kümülatif bir toksindir. Uygun koruma ile kullanın.
5. Kapsülü pipetten çıkarın ve ızgaralar kapsülün içindeyken bir filtre kağıdı parçasını ızgaraların kenarına değdirerek ızgaraları kurulayın.
6. Osmiyum tetroksit buharı inaktivasyon prosedürü.
   1. Kapağı açık olan kapsülü, %1 osmiyum tetroksit çözeltisine batırılmış filtre kağıdı içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Dikkat: Osmiyum tetroksit düşük buhar basınçlı ve son derece toksik bir maddedir. Kanallı bir BSC veya kimyasal çeker ocak içerisinde kullanılmalıdır. Uygun koruma ile kullanın. Çalışma alanına uyarı bilgileri asın.
   2. Osmiyum tetroksit buharının tamamen nüfuz etmesi için 50 mL'lik santrifüj tüpünü 1 sa boyunca kapalı tutun. Ardından, tüpü dekontamine edin ve biyogüvenlik alanından BSL-2 EM (elektron mikroskobu) tesisine transfer edin.
7. EM ızgaralarını kapsülden çıkarın.
   1. BSL-2 EM tesisinde, kapsülü santrifüj tüpünden çıkarın ve bir pipet üzerine yerleştirin.
   2. Kapsüle 40 µL DI su çekin ve suyu üç kez bir atık konteynerine boşaltın.
   3. Kapsülü pipetten çıkarın ve filtre kağıdını ızgaraların kenarına değdirerek ızgaraları kurulayın.
   4. Hava ile kurutmanın ardından, ızgaraları sonraki TEM (transmisyon elektron mikroskopisi) görüntülemesi için saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Formvar/karbon kaplı TEM ızgaraları	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g kapsülleri	EMS	85010-01	kutu
mPrep/f bağlayıcılar	EMS	85010-11	standart 16/Pk
Glutaraldehit	EMS	16320	%50 çözelti, EM sınıfı
Osmiyum tetroksit	EMS	19190	%4 sulu çözelti
Uranylasetat	EMS	22400	toz
Potasyum fosfotungstik asit	EMS	19500	toz
Filtre kağıdı	Whatman	1450-090	boyut 50
Transmisyon elektron mikroskobu	JEOL	JEM-1011	TEM