Video, saflaştırılmış RNA içermeyen bir nukleoprotein-fosfoprotein kompleksinden virüse özgü nukleokapsidlerin in vitro montajını, boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırılmalarını ve monte edilen partiküller içindeki tam uzunluktaki viral RNA'nın doğrulanmasını göstermektedir.
Yöntem makalesi
Viral Nükleokapsid Benzeri Partiküllerin In Vitro Rekonstitüsyonu ve Purifikasyonu
12 görüntülenme
⸱
30 Eylül 2026
Bu makalede
Özet
Protokol
1. Moleküler klonlama
NOT: Respiratuar sinsityal virüs (RSV) bi-sistronik koekspresyon konstrükt plazmidi oluşturmak için Ligaz Bağımsız Klonlama (LIC) kullanılmıştır. LIC, vektör ve DNA inserti arasında komplementer çıkıntılar oluşturmak için T4 DNA polimerazın 3’-5’ Ekzo aktivitesini kullanan, 1990'ların başında geliştirilmiş bir yöntemdir. Konstrüktler, açık okuma çerçevesinin (ORF) N-terminalinde 10x His etiketi bulunan 2BT-10 vektör DNA'sı kullanılarak oluşturulmuştur (Şekil 1).
- SSPI sindirimi kullanarak LIC vektörlerinin lineerizasyonunu gerçekleştirin.
- 10 μL SSPI 10X tamponu, 5 U/μL konsantrasyonunda 4 μL SSPI enzimi, 5 μg vektör miniprep DNA'sına eşdeğer hacim ve 100 μL'ye tamamlayacak kadar steril ddH2O'yu birleştirin.
- Sindirimi 37 °C'de 3 saat boyunca inkübe edin.
- Vektör DNA'sının ekstraksiyonu için sindirilmiş ürünü %1,0'lık agaroz jelde yürütün.
- Ekstraksiyon ve saflaştırmayı gerçekleştirmek için bir jel ekstraksiyon kiti kullanın. Final vektör DNA hacmini 30 μL ddH2O içinde süspanse edin ve -20 °C'de saklayın.
N1-391 Forward Primer, N1-391 Reverse Primer, P1-126 Forward Primer ve P1-126 Reverse Primer kullanarak N1-391 ve P1-126 için DNA insertlerini hazırlayın (Tablo 1).
NOT: Lineerize vektör ile 55 °C ile 60 °C arasında bir erime sıcaklığı sağlamak için yeterli örtüşme mevcuttur. Reverse primer için, aynı nedenden dolayı lineerize vektörün ters tamamlayıcı zinciri ile yeterli örtüşme bulunmaktadır.
Tablo 1. Primer dizileri.
Primerler Dizi N1-391 Forward 5’-TACTTCCAATCCAATGCAATGGCCCTGAGCAAAGTGAAG-3’ N1-391 Reverse 5’-TTATCCACTTCCAATGTTATTACAGTTCCACGTCGTTGTCCTTGG-3' P1-126 Forward 5’-TACTTCCAATCCAATGCAATGGAAAAGTTCGCCCCCGAG-3' P1-126 Reverse 5’-TTATCCACTTCCAATGTTATTACTGGTCGTTGATTTCCTCGTAGC-3’ - DNA insertinin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonunu Tablo 2 ve Tablo 3'teki koşulları kullanarak gerçekleştirin.
- Amplifiye DNA insertini ekstrakte edin. Önceki adımdaki PCR ürünlerini %1,0'lık agaroz jelde yürütün, ardından bantları jel ekstraksiyonu ile ekstrakte edip saflaştırın. Ekstrakte edilen DNA'nın final hacmini 15 μL ddH2O içinde süspanse edin.
Tablo 2. DNA inserti PCR amplifikasyonu reaktifleri.
DNA inserti PCR amplifikasyonu 15 μL 10x Pfu polimeraz reaksiyon tamponu 3 μL Forward primer (100 μM konsantrasyonu) 3 μL Reverse primer (100 μM konsantrasyonu) 15 μL 2,5 mM konsantrasyonunda Deoksiribonükleotid Trifosfat (dNTP) karışımı 6 μL N veya P genini içeren Plazmid DNA (100ng/ μL) 7 μL Dimetil Sülfoksit (DMSO) 3 μL 2,5U/μL Pfu polimeraz 150 μL'ye tamamlanacak hacim Steril ddH2O Tablo 3. DNA inserti PCR amplifikasyonu termal döngü programı.
DNA inserti PCR amplifikasyonu Adım Süre Sıcaklık Döngü Denatürasyon 4 dk. 95 ºC 1 Denatürasyon 45 sn. 95 ºC 30 Bağlanma (Annealing) 30 sn. 62 ºC Uzama (Extension)* 90 sn. 72 ºC Uzama 10 dk. 72 ºC 1 Bekletme (Hold) ∞ 4 ºC 1 150 μL'lik karışım üç ayrı PCR reaksiyonu (3 x 50μL) şeklinde yürütülebilir. *Pfu DNA polimeraz için uzama fazı için önerilen hız 1 kb/dk'dır. Burada, hem N1-391 geninin hem de P1-126 geninin uzunlukları 1,5 Kb'den kısadır. Bu nedenle uzama adımı için 90 saniye kullanılmıştır. Vektör ve insert DNA'sının T4 DNA polimeraz işlemi (Tablo 4).
Tablo 4. T4 DNA polimeraz işlemi.
T4 DNA polimeraz işlemi 10 x Tampon 2 μL Vektör/Insert DNA (0,1 pmol vektör veya 0,2 pmol insert) 5 μL 25 mM dNTP* 2 μL 100 mM DTT 1 μL T4 DNA polimeraz (LIC kalifikasyonlu) 0,4 μL (1,25 U) Steril ddH2O 9,6 μL *Vektör için dGTP, insert DNA için ise dCTP kullanılmıştır. NOT: İşlem, vektör DNA ve insert DNA için ayrı ayrı gerçekleştirilmelidir.
- Karışımı oda sıcaklığında 40 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, polimerazı 75 °C'de 20 dakika boyunca ısı ile inaktive edin. Reaksiyon karışımını -20 °C'de saklayın.
- LIC vektörü ve insert vektörünü bağlayın (annealing).
- 2 μL LIC vektör DNA'sı ve 2 μL steril ddH2O ile bir negatif kontrol kurun.
- Önceki T4 DNA polimeraz reaksiyonlarından elde edilen 2 μL insert DNA ve 2 μL LIC vektör DNA'sını 0,2 mL'lik bir tüpte birleştirin.
- Bağlanma reaksiyonunu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca gerçekleştirin.
- Reaksiyonu 25 mM konsantrasyonunda 1,3 μL Etilendiamintetraasetik Asit (EDTA) ile söndürün.
- Reaksiyonu 100 μL Escherichia coli Top10 kompetan hücrelerine transforme edin ve ampisilin seleksiyon plakalarına ekin.
- Pozitif konstrüktleri belirleyin.
- Plazmid miniprep solüsyonunu hazırlayın. Bu, koloni seçimi ve Luria Broth (LB) besiyerine inokülasyon yoluyla yapılabilir. Genellikle 3 koloni yeterlidir.
- Karışımı 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.
- Karışımı 4.560 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı atın.
- Peletleri 250 μL P1 tamponu içinde yeniden süspanse edin ve bir spin miniprep kiti kullanarak plazmid miniprep'lerini hazırlayın.
- AseI veya diğer restriksiyon enzimleri kullanarak miniprep ürününün sindirim analizini gerçekleştirin.
- Örnekleri %0,8'lik agaroz jele yükleyin ve sindirilmiş plazmidi yürütün. Jeli UV lamba altında analiz edin.
- Pozitif ürünün dizisini doğrulamak için bir sekanslama hizmeti kullanın.
Koekspresyon DNA insertini elde edin.
- Önceden oluşturulmuş 2BT-10 N1-391 ve 2BT-10 P1-126'yı kalıp olarak kullanarak N1-391 ve P1-126'yı elde etmek için PCR gerçekleştirin.
- N1-391 Forward primer ve 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCGCGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́ Reverse Primer ile Tablo 2 ve Tablo 3'teki PCR koşullarını kullanarak 2BT-10 N1-391 konstrüktünden N1-391 elde etmek için 1. PCR'ı gerçekleştirin.
- Forward primer: 5’-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGCAGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́ ve P1-126 Reverse primer kullanarak 2BT-10 P1-126 konstrüktünden P1-126 elde etmek için 2. PCR'ı gerçekleştirin (Tablo 2 ve Tablo 3'teki PCR koşullarını kullanın).
- Son olarak, N1-391 ve P1-126'yı birleştirmek için önceki 2 PCR reaksiyonunun karışık ürünleri üzerinde örtüşme (overlap) PCR gerçekleştirin. N1-391 Forward primer ve P1-126 Reverse primer kullanın. Tablo 5 ve Tablo 6'daki PCR koşullarını kullanın.
Tablo 5. Örtüşme PCR reaktifleri.
Örtüşme PCR 15 μL 10 X Pfu polimeraz reaksiyon tamponu 3 μL Forward primer (100 μM) 3 μL Reverse primer (100 μM) 15 μL dNTP Karışımı (2,5 mM) 3 μL 1. tur PCR'dan elde edilen N1-391 genini içeren DNA (100 ng/μL) 3 μL 1. tur PCR'dan elde edilen P1-126 genini içeren DNA (100 ng/μL) 7 μL DMSO 3 μL Pfu polimeraz (2,5 U/μL) 150 μL'ye tamamlanacak hacim Steril ddH2O Tablo 6. Örtüşme PCR termal döngü programı.
Örtüşme PCR Adım Süre Sıcaklık Döngü Denatürasyon 4 dk. 95 °C 1 Denatürasyon 45 sn. 95 °C 30 Bağlanma (Annealing) 30 sn. 62 °C Uzama (Extension)* 2 dk. 72 °C Uzama 10 dk. 72 °C 1 Bekletme (Hold) ∞ 4 °C 1 150 μL'lik karışım üç ayrı PCR reaksiyonu (3 x 50 μL) şeklinde yürütülebilir. *Pfu DNA polimeraz için uzama fazı için önerilen hız 1 kb/dk'dır. Burada, N1-391 ve P1-126 genlerinin toplam uzunluğu 2,0 Kb'den kısadır. Bu nedenle uzama adımı için 2 dakika kullanılmıştır. - Vektörü ve DNA insertini birleştirin.
- Örtüşme PCR ürününü adım 1.3'teki protokole uygun olarak T4 DNA polimeraz ile işleyin.
- LIC vektörünü ve PCR ürününü adım 1.4'teki protokole uygun olarak bağlayın (annealing).
- Pozitif konstrüktleri adım 1.5'teki protokole uygun olarak belirleyin.
2. Protein ekspresyonu ve purifikasyonu
NOT: N ve P'nin birlikte ekspresyonu için bi-sistronik konstrükt ile E. coli kullanın. Hücreleri 37 °C'de kültüre edin, ancak ekspresyonu gece boyunca düşük sıcaklıkta (16 °C) gerçekleştirin. Protein komplekslerini kobalt kolon, iyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisinin bir kombinasyonu ile saflaştırın (Şekil 2).
- Protein üretimi için E. coli BL21(DE3) suşunu kullanın. 4 L hücre kültürünü, OD600 0,6 değerine ulaşana kadar LB (Luria Broth) besiyerinde 37 °C'de büyütün.
- Sıcaklığı 16 °C'ye düşürün. Bir saat sonra, ekspresyonu 0,5 mM İzopropil β-D-1-tiyogalaktopiranozid (IPTG) ile gece boyunca indükleyin.
- Hücreleri 4.104 x g'de 25 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatantı atın.
- Hücre peletlerini 200 mL liziz tamponu A (50 mM sodyum fosfat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 mM imidazol, %10 gliserol ve %0,2 NP40) içinde yeniden süspanse edin. 1 L hücre kültüründen elde edilen hücre peletlerini yeniden süspanse etmek için 50 mL liziz tamponu kullanın.
Hücreleri sonikasyonla 15 dakika boyunca, 3 saniye açık ve 3 saniye kapalı şeklinde lize edin. Ardından hücreleri 37.888 x g'de 40 dakika santrifüjleyin.
NOT: Protokol, sonikasyon öncesinde hücrelerin -80 °C dondurucuda dondurulmasıyla durdurulabilir.
- Süpernatantı, 5-10 kolon hacmi (CV) liziz tamponu ile önceden dengelenmiş yaklaşık 10 mL boncuk içeren bir kobalt gravite kolonuna (çap x uzunluk: 2,5 cm x 10 cm) yükleyin.
- Kolonu 5 CV tampon B (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, %10 gliserol ve 5 mM imidazol) ve 5 CV tampon C (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl, %10 gliserol ve 5 mM imidazol) ile yıkayın.
- Proteini, 2 CV tampon D (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl ve 250 mM imidazol) kullanarak boncuklardan elüye edin.
- Elüye edilen proteini, Q kolonu için QA tamponu (50 mM Tris-HCl pH 8,0, %5 Gliserol) ile 5 kat seyreltin.
- Kolonu dengelemek için 5 mL'lik Q kolonunu QA tamponu ile yıkayın, ardından seyreltilmiş örneği peristaltik pompa (örneğin, Rabbit) kullanarak Q kolonuna yükleyin.
- Q kolonunu, QA tamponu ve QB tamponu (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1,5 M NaCl, %5 gliserol) ile birlikte HPLC cihazına yerleştirin. Akış hızını 1 mL/dk olarak ayarlayın.
- Cihazı önce QB tamponu ve ardından QA tamponu (her biri 1-2 CV) ile yıkamak için “pompa yıkama” (pump wash) programını çalıştırın. Sistem akışını 3 mL/dk'ya ayarlayın.
- UV1'i 280 nm ve UV2'yi 260 nm olarak ayarlayın. Fraksiyonları toplamak için 96 kuyucuklu derin plak kullanın.
- Proteinleri, her konsantrasyonda 3-4 CV uygulayarak ve %0 QB'den başlayarak yüzdesini her seferinde %5 artırarak kademeli bir elüsyon ajanı (QB Tamponu) gradyanı ile elüye edin. N0P protein kompleksi %15 QB Tamponu ile çıkacaktır.
- Tüm protein elüye edildiğinde, kolonu %100 QB Tamponu (2 CV) ile yıkayın.
- Proteini, Superdex 200 Increase 10/300 GL jel filtrasyon kolonu (çap x uzunluk: 1,0 cm x 30 cm) ile izole edin ve tampon E (20 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit veya HEPES pH 7,4 ve 200 mM NaCl) ile dengeleyin.
- Protein içeren fraksiyonları sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile analiz edin.
3. Virüse özgü NC'nin in vitro montajı
NOT: RSV-spesifik NC'nin (N:RNA) in vitro montajı, hazırlanan N0P kompleksinin RNA oligoları ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilmiştir. Ardından, montaj kompleksini N0P ve fazla RNA'dan ayırmak için boyut dışlama kromatografisi (SEC) kullanılmıştır (Şekil 2).
- Saflaştırılmış N0P kompleksini, RNA oligo ile 1:1.5 molar oranında oda sıcaklığında 1 saat boyunca karıştırın ve inkübe edin; genellikle bir sonraki adım için 1 mg/mL konsantrasyona sahip 1 mL N0P proteini yeterlidir. Sadece aynı miktarda N0P proteini içeren kontrol örneğini hazırlayın.
- Gel filtrasyon Superdex 200 Increase 10/300 GL kolonunu tampon E (20 mM HEPES, pH 7.4, 200 mM NaCl) ile ön dengelemeye tabi tutun.
- Örneği 21,130 x g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin, oluşan çökmeleri uzaklaştırın ve süpernatantı SEC kolonuna yükleyin.
- N:RNA montaj örneği ile N0P kontrol örneğinin SEC kromatografi görüntülerini karşılaştırın; hangi piklerin monte edilmiş N-RNA, N0P ve serbest RNA olduğunu belirlemek için A260/A280 oranını birlikte değerlendirin.
- Pik fraksiyonlarını toplayın, SDS-PAGE jeli çalıştırın veya gridler hazırlayın.
- Montajlanan N-RNA kompleksi için, N-RNA pikiyle ilişkili tüm fraksiyonları toplayın, RNA ekstraksiyonu yapın ve ilk adımda karıştırılıp inkübe edilenle aynı olan spesifik RNA uzunluğunu iki kez kontrol etmek için Urea-PAGE jeli çalıştırın.
Sonuçlar
Şekil 1. Plazmid konstrüksiyonlarının illüstrasyonu. A. RSV N1-391 konstrüksiyonu; B. RSV P1-126 konstrüksiyonu; C. N1-391 ve P1-126'nın ko-ekspresyonu için bi-sistronik konstrüksiyon. İlk gen RSV N1-391, ikinci gen RSV P1-126, antibiyotik direnç geni (AmpR) ve promotörler sırasıyla sarı, camgöbeği, pembe ve turuncu kutularla vurgulanmıştır. Özetle, RSV N1-391 ve RSV P1-126 gen ekleri ayrı ayrı oluşturulmuş ve birleştirilmiştir.
Şekil 2. N1-391P1-126 protein kompleksinin saflaştırma akış şeması. Şemada, E. coli hücre kültürünün inokülasyonu ve büyük ölçekli büyütülmesi ile hücrelerin santrifüj yoluyla hasat edilmesi özetlenmiştir. Hücre lizini ardından, protein örnekleri afinite kromatografisi (örneğin, Co2+ kolonu), iyon değişim kromatografisi (örneğin, Q kolonu) ve jel filtrasyon boyut dışlama (SEC) kromatografisi ile saflaştırılır. Protein örnekleri daha sonra SDS-PAGE jeli ile analiz edilir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Agarose | SIgma | A9539-500G | LIC yöntemi kullanılarak konstrükt oluşturma |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | hücre kültürü için antibiyotik |
| AseI | NEB | R0526S | LIC yöntemi kullanılarak konstrükt oluşturma |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | His-tag protein saflaştırması için |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Numuneyi ısıtma |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | LIC yöntemi kullanılarak konstrükt oluşturma |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | LIC yöntemi kullanılarak konstrükt oluşturma |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | çözelti hazırlama |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | çözelti hazırlama |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein saflaştırma |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | çözelti hazırlama |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | protein ekspresyonunu indükleme |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | PCR için |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | hücre lizisi için sonikatör |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | hücre kültürü için çalkalayıcı |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | çözelti hazırlama |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | DNA saflaştırma |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | LIC yöntemi kullanılarak konstrükt oluşturma |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein saflaştırma |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | LIC yöntemi kullanılarak konstrükt oluşturma |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Santrifüj, maksimum hız 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | çözelti hazırlama |
