Video, immünositokimya kullanılarak enfekte epitelyal hücrelerde Zika viral dsRNA ara ürünlerinin tespitini göstermektedir. Enfekte hücreler fikse edilir ve ardından bir bloklama çözeltisi ile bloklanır. Primer ve sekonder antikorlar eklenir. Çekirdekler floresan bir boya ile boyanır. İşaretlenmiş viral dsRNA daha sonra bir floresan mikroskobu altında gözlemlenir.
Yöntem makalesi
İmmünositokimya Kullanılarak Zika Viral dsRNA Replikasyon Ara Ürünlerinin Tespiti
14 görüntülenme
⸱
30 Eylül 2026
Bu makalede
Özet
Protokol
1. Zika viral genom replikasyon analizi
- Naif Vero hücrelerini 12 kuyucuklu bir plaka kullanarak kuyucuk başına 1 x 105 hücre olacak şekilde 2 ml hacimlerde ekini yapın. Ertesi gün, serumsuz ortam kullanarak üç tekrarlı olarak düşük ve yüksek titreye sahip viral inokulumlar (Enfeksiyon Çokluğu (MOI) 0,01 ve 0,1; 400 µl/kuyucuk) hazırlayın. Mock enfeksiyon için sadece serumsuz ortam (400 µl/kuyucuk) kullanın.
- İnoküle edilmiş plakayı 37 °C'de %5 CO2 ile 4-6 saat inkübe edin. İnokulumu, plakayı her bir saatte bir nazikçe yanlara eğerek yayın.
- İnkübasyonun sonunda, inokulumu serum takviyeli ortam (kuyucuk başına 2 ml) ile değiştirin.
- 48 ve 96 saatlik zaman noktalarında, immünositokimya (ICC) için örnekleri toplayın.
- Metanol ile fikse edilmiş hücreleri kullanarak ICC gerçekleştirin.
- Fikse edilmiş hücreleri 1x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile üç kez yıkayın ve ICC bloklama tamponu (%3 keçi serumu, %3 Sığır serum albümini (BSA), PBS içinde %0,1 Triton-x 100) ile bloklayın.
- Fare monoklonal anti-dsRNA antikoru J2'yi (1 µg/ml), bloklama tamponunda 1:100 dilüsyonunda kullanın ve 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.
- Hücreleri 1x PBS ile yıkayın ve ikincil antikor keçi anti-fare IgG-594'ü (1 µg/ml), bloklama tamponunda 1:1.000 dilüsyonunda ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.
- Hücreleri 1x PBS ile yıkayın, çekirdekleri Hoechst boyası ile boyayın ve hücreleri 100X büyütmede floresan mikroskop kullanarak gözlemleyin (Şekil 1).
Sonuçlar
Şekil 1: Zika virüsü (ZIKV) replikasyonunu değerlendirmek için kullanılan analizler. (A) Grafik, Ters Transkripsiyon Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-qPCR) ile ölçülen Zika virüsü genomik içeriğini göstermektedir. Hem pan-genotip (ZIKV GEN) hem de PRVABC59-suşu (ZIKV UNI) primerleri eşit hassasiyet ve özgüllük göstermiştir. Beklendiği üzere, hepatit C virüs (HCV) primerleri herhangi bir ürün amplifiye etmemiştir. (B) Grafik, düşük ve yüksek titerle enfekte edilmiş hücrelerde belirtilen zaman noktalarındaki Zika viral büyüme kinetiğini, enfekte edilmemiş mock kontrol ile karşılaştırmalı olarak sunmaktadır. Ortalama değerler ve standart sapmalar verilmiştir. (C) Viral replikasyonu incelemek için yapılan immünositokimya analizi. Zika virüsü ile enfekte hücreler, dsRNA antikorları ile spesifik olarak boyanmıştır. 48 hpi'da enfekte hücreler birkaç küme halindeyken, 96 hpi'da hücrelerin çoğu enfekte olmuştur. Çekirdeklerin görselleştirilmesi için Hoechst boyası kullanılmıştır (Ölçek çubuğu = 50 µm). BF: Bright field (aydınlık alan) görüntüsü.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| Vero Hücre Hattı | ATCC | CCL-81 | |
| Zika viral suşu PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| Nikon Intenselight C-HGFI'lı Nikon Eclipse Ti İmmünofloresan Mikroskobu | Nikon | Talep için Nikon'u ziyaret edin |
