Viral Partiküllerin Konsantrasyonu ve Saflaştırılması

Özet

Kaynak: Fricano-Kugler, C. J., et al. Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (2016).

Bu video, konak hücre kalıntıları içeren karışık bir süspansiyondan lentiviral partiküllerin konsantre edilmesi ve saflaştırılmasına yönelik adım adım süreci göstermektedir. Prosedür, çözünür safsızlıkları uzaklaştırırken viral partikülleri izole etmek için santrifüjleme, filtrasyon ve PEG-tuz çöktürme yöntemlerini kullanır. Nihai ürün, viral enfektiviteyi ve yapısal bütünlüğü korumak amacıyla bir tampon çözeltide yeniden süspanse edilir ve ultra düşük sıcaklıklarda saklanır.

Protokol

1. Virüsün Konsantrasyonu ve Saflaştırılması

1. ddH₂O'ya %40 polietilen glikol 6000 ve 1.5 M NaCl ekleyerek 5x polietilen glikol 6000 çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi sıvı döngüsünde 121 °C'de 45 dk boyunca otoklavlayın. Soğuma sırasında çözeltiyi yavaşça karıştırın.
   NOT: Çözelti başlangıçta bulanık olacak ve soğudukça berraklaşacaktır.
2. Çözünmeyen maddeleri çöktürmek için, her iki viral süpernatan koleksiyonunu içeren 50 ml'lik konik tüpü 2,000 x g'de 10 dk boyunca santrifüjleyin. Viral medyumu 0.45 µm düşük protein bağlayıcı şırınga filtresinden (PES veya PVDF) süzerek saflaştırın.
3. Medyuma 5x polietilen glikol 6000 çözeltisi ekleyin (final konsantrasyon %8 polietilen glikol 6000 ve 0.3 M NaCl olmalıdır). Tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın (vortexlemeden kaçının). Virüs içeren polietilen glikol çözeltisini 4 °C'de 12 saat veya daha fazla, ara ara tekrar karıştırarak inkübe edin.
4. (9. Gün) Virüs içeren polietilen glikol çözeltisini 2,500 x g'de 45 dk boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı uzaklaştırıp atın ve tekrar 2 dk boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı yeniden uzaklaştırıp atın.
5. Pellet'i 320 µl steril fosfat tamponlu salin ekleyerek (320 µl, toplanan virüs içeren medyumun orijinal hacminin 1/100'üdür) yeniden süspand edin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Opsiyonel olarak, pellet'i oda sıcaklığında bir sarsıcılı (rocker) üzerinde 30 dk boyunca yeniden süspande edin.
6. Pellet yeniden süspande edildikten sonra virüsü alikotlayın (0.5 ml'lik tüp başına 5-10 µl) ve alikotları -80 °C'de dondurun (dondurup çözme veya 4 °C'de saklama titer değerini önemli ölçüde düşürecektir).
7. Standart protokolleri kullanarak virüsleri titre edin; örneğin, HEK293T hücreleri içeren 6 kuyucuklu bir plaka üzerinde dilüsyon serisi gerçekleştirin ve 48 saat sonra floresan kolonileri manuel olarak sayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Transfeksiyon Reaktifleri Listesi
5 ml polistiren tüpler	Fisher Scientific	352054
polietilen glikol 6000 (PEG 6000)	Millipore	528877
(10x) Fosfat Tamponlu Salin (PBS)	Ulusal Tanı Hizmetleri	CL-253
0,5 ml mikro santrifüj tüpleri	USA Scientific	1605-0000
Matrigel	Fisher Scientific	CB-40230A