Viral Plak Analizleri için Sıvı Bir Üst Katman Sisteminin Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Baer, A. ve Kehn-Hall, K. Plak Sayım Yöntemleriyle Viral Konsantrasyon Tayini: Geleneksel ve Yeni Overlay Sistemlerinin Kullanımı. J. Vis. Exp. (2014).

Bu video, sıvı mikrokristalin selüloz tabanlı bir örtü katmanının plak bazlı bir analizdeki kullanımını, viral plak oluşumundaki etkinliğini geleneksel yarı katı agaroz örtü katmanı ile karşılaştırarak göstermektedir.

Protokol

1. Hücrelerin ve reaktiflerin hazırlanması

1. Deneyden bir gün önce, söz konusu virüs için uygun konak hücreleri (%90 - %100 konfluens düzeyinde) ekleyin (Tablo 1 ve Tablo 2).
2. H₂O içinde %10'luk formaldehit sabitleme çözeltisi hazırlayın. Örnek olarak, 5,56 ml %36'lık stok formaldehiti 14,44 ml distile H₂O (dH₂O) ile karıştırın.
   NOT: Formaldehit kullanırken uygun güvenli kullanım uygulamalarını ve havalandırmayı sağlayın.
3. Kristal viyole boyasını hazırlayın: %20 etanol ve dH₂O içinde %1 kristal viyole (CV).
4. 2x plak besiyeri hazırlayın (hücre tipine bağlı olarak 2x konsantrasyonda; bkz. Tablo 2). Herhangi bir reaktif steril değilse 0,2 µm filtre kullanarak filtreleyin.
5. İmmobilizasyon örtülerinin hazırlanması (Tablo 3)
   1. Sıvı örtüler için, dH₂O içinde steril %2,4'lük Avicel çözeltisi hazırlayın. Topaklanmayı önlemek için, tozu manyetik karıştırıcı ile hızla karıştırılan su içeren bir erlene yavaşça ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) hızla karıştırın. Çözelti, manyetik karıştırıcının homojenize edemeyeceği kadar viskoz hale geldiğinde, eşit homojenizasyon sağlamak için şiddetli ajitasyonla >30 dk boyunca flask shaker'a geçin.
      NOT: Stok çözeltiler daha düşük konsantrasyonlarda hazırlanabilir, ancak çözeltiler ayrışabilir ve homojenizasyonu sağlamak için yeniden karıştırılmaları gerekir. %0,6-3 aralığında Avicel çalışma çözeltileri kullanılabilir.
   2. Homojenizasyondan sonra çözeltiyi otoklavlayın ve oda sıcaklığında (RT) ağzı kapalı olarak saklayın.
   3. Agaroz ve karboksimetil selüloz (CMC) örtüler için, dH₂O içinde %2 CMC veya %0,6 agaroz stok çözeltisi hazırlayın. Manyetik karıştırıcı ile karıştırın ve çözeltiye getirmek için otoklavlayın veya mikrodalga fırına koyun.

2. Dilüsyonlar ve enfeksiyonlar

1. Ekili günün ertesi günü, deneye başlamadan önce hücrelerin konfluensini ve viabilitesini görsel olarak kontrol edin. Standart hücresel morfolojinin mevcut olduğundan ve ~90% konfluent bir monolayer oluştuğundan emin olun.
2. Enfeksiyöz örneklerin on katlı seri dilüsyonunu gerçekleştirin. Dilüent olarak viral propagasyon için kullanılan hücresel büyüme medyumunu kullanın (Tablo 2). Dilüsyon sayısını, söz konusu virüsün beklenen titresine göre belirleyin ve hücresel viabiliteyi bağımsız olarak doğrulamak ve plak tanımlamasına yardımcı olmak için her zaman enfekte edilmemiş bir kontrol örneği kullanın.
3. Seri dilüsyonlardan gelen örneklerle hücreleri 45 dk ila 1 saat boyunca enfekte edin (Tablo 1). Hücreleri kaplayacak yeterli miktarda inokulum kullanın, ancak viral temasın monolayer ile maksimize edilmesi için hacmi mümkün olduğunca düşük tutun (Tablo 4). Eşit dağılımı sağlamak ve hücresel monolayer'ın kurumasını önlemek için plakları her 20 dakikada bir nazikçe sallayın.
4. Enfeksiyondan sonra, 2x plak medyumu ve seçilen immobilizasyon overlay'inin (CMC, agaroz veya Avicel) 1:1 karışımını kullanarak, kuyucuktaki inokulumların üzerine doğrudan uygun hacimde immobilizasyon medyumu ekleyin (Tablo 2). Karıştırmak için nazikçe sallayın.
   1. Sıvı overlay'ler için, 0.6-1.2% Avicel overlay medyumu çalışma çözeltisi elde etmek amacıyla, ısıtılmış 2x plak medyumu ile 1.2 - 2.4% RT stok Avicel'i 1:1 oranında karıştırın.
   2. Agaroz overlay için, ısıtılmış 2x plak medyumu ile ısıtılmış 0.6% agaroz stok çözeltisinin 1:1 karışımını kullanın; sıcaklığı dengelemek ve final agaroz/overlay konsantrasyonunu 0.3% seviyesine getirmek için 30 dk boyunca 56 °C su banyosunda bekletin.
   3. CMC için, %2'lik bir stok çözelti hazırlayın ve agaroz overlay için tarif edildiği şekilde işlem uygulayın.
   4. Overlay'i monolayer'a uygularken, monolayer'a zarar vermeyi önlemek için sıcak agaroz veya CMC'yi her zaman 56 °C suda dengeleyin. Hücre ölümünü ve viral titrelerin düşmesini önlemek için çözeltinin ılık olduğundan, ancak dokunulduğunda sıcak olmadığından emin olun. Çoğu agaroz overlay 42 °C'nin altında katılaşmaya başlayacaktır; işlem sırasında katılaşmayı önlemek için hızlı çalışın ve/veya küçük partiler hazırlayın.
5. Overlay eklemesinden sonra, net bir şekilde sayılabilen belirgin plaklar oluşturmak için plakları inkübe edin. Plak oluşumu, analiz edilen virüse bağlı olarak 2–14 gün sürebilir (Tablo 1).
   NOT: Sıvı overlay uygulanmış plaklar inkübatöre yerleştirildikten sonra onları hareket ettirmeyin. İnkübasyon süresi boyunca sıvı overlay'lerin hareket ettirilmesi, plakların yayılmasına (smearing) neden olur. Agaroz ve CMC overlay'ler yarı katıdır ve plak gelişimini izlemek için periyodik olarak hareket ettirilebilir veya ışık mikroskobu altında kontrol edilebilir.

3. Hücrelerin fikse edilmesi ve boyanması

1. Hücreleri sabitlemek için Avicel kaplamasını dökün veya aspire edin ve hücreleri %10'luk formaldehit çözeltisi ile 30 dakikadan bir geceye kadar sabitleyin (6 kuyucuklu bir plaka için kuyucuk başına <1 ml).
   1. Agaroz veya CMC için, formaldehit çözeltisini doğrudan kaplamanın üzerine ekleyip 1 saat veya bir gece bekletin.
      NOT: Numuneler, buharlaşıp kurumadığı sürece fiksatif içinde uzun süreler tutulabilir; aksi takdirde monolayer bozulabilir.
2. Boyama öncesinde ve sabitleme işleminden sonra, formaldehiti atın ve agaroz ile CMC için yarı katı tıkaçları ya akan suyla ya da manuel olarak bir spatula yardımıyla çıkarın. Boyama işleminden önce, kalıntı kaplama/fiksatifi uzaklaştırmak için Avicel plaklarını su ile durulayın.
3. Boyama için, hücrelerin üzerini minimum miktarda kristal viyole çözeltisi ile ~15 dk boyunca kapatın. Eşit kapsama sağlamak için gerekirse plakaları sallayın.
4. Kristal viyole boyasını su ile nazikçe yıkayarak uzaklaştırın. Sabitleme, boyama ve kurutma işlemleri tamamlandıktan sonra, plakları gelecekteki analizler için süresiz olarak saklayın.

Tablo 1. Plak Deneyi İnokülasyon Koşulları ve Hücre Tipleri

	RVFV	VEEV	Influenza B
Hücre tipi	Vero	Vero	MDCK
Enfeksiyon süresi	1 hr	1 hr	45 min
İnkübasyon süresi	3 days	2 days	3 days

 

Tablo 2. Plak ve Viral/Hücresel Büyüme Besiyerleri

	RVFV	VEEV	Influenza B
Hücre Tipi	Vero	Vero	MDCK
Büyütme Tipi	DMEM1	DMEM1	DMEM2
Plak Besiyeri	2xEMEMA	2xEMEMA	2xEMEMB

1. %10 Fetal Bovine Serum, %1 L-Glutamin, %1 Penisilin/Streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco's Modified Eagle Medium.

2. %1 L-Glutamin, %1 Penisilin/Streptomisin, %0,2 Sığır Serum Albümini, %0,025 HEPES, 50ug/ml DEAE-Dekstran ile takviye edilmiş Dulbecco Modifiye Eagle Besiyeri.

A. %5 FBS (25 ml), %1 Minimum Temel Amino Asitler (5 ml), %1 Sodyum Piruvat (5 ml), %1 L-Glutamin (5 ml) ve %2 Pen/Strep (10 ml) ile takviye edilmiş 2x Minimum Temel Besiyeri (500 ml).

B. %0,2 Sığır Serum Albumini, %1 Minimum Esansiyel Amino Asitler (5 ml), 50ug/ml, %0,025 HEPES, DEAE-Dekstran ve Trypsin-TPCK* ile takviye edilmiş 2x Minimum Esansiyel Besiyeri (500 ml)

*Hazırlıktan hemen önce, plaklar için agaroz ile karıştıracağınız alikota, 2 µg/ml'lik TPCK-Trypsin stok çözeltisinden her 25 ml için 1 µl ekleyin.

Tablo 3. Overlay Stokları

	RVFV	VEEV	İnfluenza B
Hücre tipi	Vero	Vero	MDCK
Enfeksiyon süresi	1 hr	1 hr	45 min
İnkübasyon süresi	3 days	2 days	3 days

 

Tablo 4. Plaka Formatları

	6 kuyucuklu	12 kuyucuklu	96 kuyucuklu
Kuyucuk başına hücre sayısı	5 x 105	2.5 x 105	3 x 104
İnokülüm hacmi (μl)	400	200	50
Üst katman hacmi (ml)	3	1.5	0.100

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kristal viyole	Sigma Aldritch	C3886-25G
Formaldehit çözeltisi	Sigma Aldritch	F8775-500ml
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer USA	RC-591 NF	Homojenize etmek için yeniden süspansiyon sırasında >30 dk boyunca kuvvetlice çalkalayın
UltraPure agaroz	Invitrogen	16500-100
Karboksimetil selüloz, sodyum tuzu orta viskoziteli	Sigma Aldrich	C4888