Sinekler Etanol Hassasiyet Tedbir Basit Yolu

Özet

Etanol sedatif etkilerini ölçmek için basit bir tahlil Drosophila Refleks düzeltilmesi kaybı dayalı sinekler, açıklanmıştır.

Özet

Düşük dozlarda etanol neden yüksek dozda sedatif ise, hiperaktif olmak için uçar. Verilen bir sinek suşu etanol bağlı sedasyon hassasiyet o gerginlik etanol tercihi ile ilişkilidir ve bu nedenle sedasyon alkol yanıtları ve içme genetik çalışma son derece alakalı bir ölçüsüdür. Biz onun sarhoş edici etkilerinin etanol ve ölçmek için sinekler ortaya çıkarmak için basit bir yol göstermektedir. Tarif testi tekrar maruz tarafından oluşturulan akut bir hassasiyet, etanolun yanı sıra hoşgörü belirleyebilirsiniz. Teknik olarak katılan bir kurulum gerektirmez ve bu nedenle temel sinek kültür araçları ile, herhangi bir laboratuvar uygulanabilir.

Protokol

1. Pozlama odasına oluşturma

1. Yarım jilet kullanarak bir şişe tapası kesin. Alternatif olarak, pamuk topları kullanın.
2. Sinekler içeri takılıp almazsınız pürüzsüz bir yüzey yapmak için bir gıda flakonun alt flakon fiş yarısı veya pamuk itin
3. Eğer birden fazla maruz odaları, flakon fiş ve gıda her odasında aynı hacimde sürebilir emin olun. Flakonun tarafında bir işareti bu kolaylaştırabilir.

2. Sinekler merceğin

1. Bir cinsiyet, yaş, maya olmadan düzenli gıda şişeleri içine maruz önce 1-5 gün gün 8 sinekleri toplayın.
2. Deneyci kullanılan gerçek genotip / zorlanma kör olduğu gibi, kod onları Etiket.
3. Pozlama odaları dokunarak içine sekiz sinekler aktarın. Uyutmak değil.
4. Kolayca görünür hale getirmek için 200 kanıtı etanol küçük bir miktar, örneğin asit mavi 9, gıda boyası ekleyin.
5. Coat 0.5 ml etanol ile bir şişe tapası altında, ya da pamuk topağı,.
6. Pozlama şişenin içine etanol takın. Alkol şişenin içine değil, flakon duvara doğru baktığından emin olun.
7. Sayan bir sayaç başlayın.

3. Kayıt etanol-indüklenen zehirlenme

1. Zamanlayıcı sonra her dakika, sinekler irkilme ve on saniye için onları gözlemlemek için poz odasında bankta dokunun.
2. Her dakika için sabit sineklerin numarasını kaydedin. Sinekler arkalarını kurtulmak edemiyorsa, tek bir yerde kalır, ya da tüm on saniyelik bir gözlem süresi boyunca kanatlarını hızla titreşmeye sabit. Ikinci sinekler, bu sineklerin büyük çoğunluğu hızlı bir kanat hareketi dönemleri arasında sabit çünkü sabit olarak kabul edilir. Sinekler arkalarını kurtulmak ve uzakta ve / veya flakon duvar kadar yürümek durumunda sabit DEĞİLDİR.
3. 4 veya daha fazla sinek sabit olarak kaydedilmektedir bir poz deneme sona erdi.
4. Sinek atın ve daha sonra yeniden kullanmak için poz odası havayı boşaltıyorum.

4. % 50 sedasyon zamanı belirleyin

Sekiz sinek dört sabit kalır etanol maruz kalma başladıktan sonra zaman zaman% 50 sedasyon (ST50). Bu aşağıdaki şekilde belirlenir:
Ya tam dört sinekler sabit olan ilk ölçüm dakika.
Veya: az dört sinekler (Y1) bir kez noktası (X dakika), ve sonraki ölçüm süresi noktada fazla dört (Y2) (X 1 dakika), sonra aşağıdaki formül kullanılarak doğrusal enterpolasyon ST50 sabit:
ST50 = (4 - Y1) / (Y2-Y1) + X

5. Hoşgörü belirlemek için poz tekrarlayın.

Sinekler merceğin

1. Deneyde kullanılan yabani tip kontrol suşu için ST50 (ağırlık) belirleyin.
2. Yukarıda açıklandığı gibi etanol sinek deneysel gruplar Açığa.
3. Kendi ST50 (1) Ölçü, ama 2x ST50 (wt) ulaşana kadar maruz devam.
4. Sineklerin boş bir gıda şişenin içine geri aktarın ve 4 saat boyunca basılı tutun.
5. Sinekler yeniden ortaya çıkarmak, ve maruz kalma 2 ST50 (2) belirlemek.

Hoşgörü belirleyin

X100 - (1 ST50 (2) / ST50 (1))% tolerans hesaplayın.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

Burada gösterilen, genotip ve doz başına düşen sinek 6-8 şişe ile elde edilen bazı temsilcisi sonuçları. Standart hata ölçüde büyükse, daha sonra sistematik bir sorun muhtemelen meydana. Etanol odaları aynı hacimde olduğunu maruz kalma odalarına karşı karşıyadır ve bu emin olun.

Vahşi tip Şekil 1 doz yanıt eğrisi artan etanol yüzdeleri maruz uçar. Sinek Sekiz şişe doz ve cinsiyet başına maruz bırakıldı. Erkek ve dişi sinekler, her doz (p> 0.22, 2-yönlü ANOVA) aynı ST50 ST50 dozlarda çapında artan etanol doz (p <0,001) ile önemli ölçüde azalır. Aşırı kalabalık şişe uçar sağlıklı şişelerden oldukça küçük olabilir ve bu boyut farkı ST50 etkileyebilir. Tohum 15-20 kadın ile her şişe şişe başına optimal larva yoğunluğu elde etmek için 1-2 gün için döşeme.

Şekil 2 veya% 90 veya% 100 etanol sinekler merceğin beyaz rabbit1 mutation2 (p <0.001, 2-yönlü ANOVA) neden daha önce açıklanan etanol-direnç üretir.

Şekil 3, 4 saat kurtarma aralığı aralıklı,% 100 etanol maruz tekrarlayın, ikinci maruz kalma (p <0.001, eşleştirilmiş t sonra ST50 önemli bir artışa neden olur-Testi). Sinekler ilk pozlama (iki katına na ve ST50 tekabül eden) sırasında 24 dakika boyunca maruz kaldığı unutmayın. Yeniden pozlama (veriler gösterilmemiştir) üzerine ST50, kısa bir süre (12 dakika) miktarı için maruz kalma önemli bir artışa neden olmadı.

Tartışma

Bu sunumda, Bainton ve arkadaşları tarafından açıklanan önceki denemelere göre etanol bağlı zehirlenme belirlemek için basit bir şekilde özetlenmiştir var. 2000 ¹ ve Rothenfluh ve ark. 2006 ^2. Alkol tercih ³ alkole bağlı sedasyon ile ilişkili olduğundan, bu testte alkol kullanım bozuklukları çalışma için ilgili. Açıklanan tahlil irkilme-kaynaklı olumsuz geotaxis dayanarak ve nasıl bir alkol maruz kalma, bu doğuştan gelen bir tepki ile müdahale. Pozlama başlamadan önce, tüm sinekler sinekler yiyecek flakon aşağı düğmesine dokunduktan sonra, hepsi bir 10 saniye gözlem süre içinde aşağıdan yukarıya hareket etmelidir, yani böyle bir irkilme normal bir tepki gösterir emin olun. Örnekler azalır olumsuz geotaxis olan sinekler bang-duyarlı nöbet mutantlar ⁵ ve ⁶ dopamin nöron dejenerasyonu ile lokomosyon eksikliği sinekler neden sayılabilir.

Açıklanan tahlil nispeten basit olsa da, iki değişken tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için en ilgi duymaktadırlar. İlk olarak, tüm maruz şişeleri aynı hacimde olmalıdır. Bu flakon alt aynı gıda + flakon fiş / pamuk hacminin yanı sıra her flakon için de aynı mesafe takmadan etanol içeren fiş içerdiğinden emin içerir. Bu testte tamamen boş bir flakon için kullanılan, ancak testinin verim azalmakta, uzun ST50 değerlere neden olabilir.

Bu testte de tekrar etanol maruz kalma üzerine geliştirmek tolerans sinek miktarını belirlemek için uygundur. Tekrar pozlama yaparken değişkenlerin sayısı göz önüne alınmalıdır. İlk olarak, inter-pozlama aralığı burada 4 saat olarak tarif edilir. Bu değişken değişti, ama biz ilk pozlama etanol temizlenmesi sağlamak için, 2 saatten daha düşük olmamalıdır. Scholz et al. 2000 ⁴ etanol tolerans geliştirme ve çürüme kinetiği. İkinci değişken dikkate alınması gereken ilk maruz kalma süresi. Bu tabii ki, kontrol ve deney sinekler için aynı olmak zorundadır. Ancak, bu sinek suşları hem de teslim etanol aynı miktarda olmayabilir. Bu nedenle, daha önce daha yüksek bir doz daha sonra sedatif gerginlik alabilirsiniz sedates büyük bir yük sedasyon sinekler ^aktif sinek 2'den daha fazla etanol emer ve böylece daha yüksek bir başlangıç ​​dozu nedeniyle daha fazla tolerans geliştirmek. Önemle okuyucu ilk ST50 (1) farklılıklar göstermektedir suşları tolerans geliştirme karşılaştırırken dikkatli olun.

Biz burada açıklamak tahlil, kolay ve tekrarlanabilir alkol sinekler davranışsal tepkilerin belirlenmesinde yararlı bir araçtır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Maruz bırakma tüpleri	www.flystuff.com	32-116
Tıkaçlar	www.flystuff.com	49-102
Acid Blue 9	Sigma-Aldrich	861146