Pre-implantasyon Genetik Tanı için FISH

1. Parçalama ve biyopsi blastomer Nucleus Yayılma

1. Yayılan hücreleri (% 0.2 Tween20 0,01 M HCl, pH 2.0) için hücre lizis tamponu 24 saat önceden hazırlanan ve -20 ° C'de saklanan olmalıdır 20 ml steril bir şırınga ve şırınga filtresi kullanarak 30 ml steril evrensel konteyner içine 100 ml ve 20 ml filtre hazırlayın. 10-15 1.7 ml steril mikrosantrifüj tüpler içine 1 ml alikotları koyun, kapatın ve önce donmaya karşı tüpler etiket. Bu, yeni bir toplu iş tatmin edici olup olmadığını test edilmiş ve kullanılabilir kullanımı iki farklı gruplar halinde, yeni bir parti ve bir önceki toplu, olması tavsiye edilir.
2. Defrost biyopsi işlemi 30 dakika önce oda sıcaklığında lizis tamponu. Pratik amaçlar için çalışma sıcaklığı, oda sıcaklığı ve el sıcaklık arasında olacaktır.
3. Bir elmas kalem ve ön-etiket durumunda numarası, benzersiz slayt numarası ve biyopsi tarihinden ile slayt kullanarak bir amin kaplı slayt (örneğin Genetix) alt kısmında küçük bir daire (yaklaşık 5 mm çapında) Puan. Ayrı bir sayısal sırayla her blastomer slayt ve embriyo sayısı ile etiket kullanın. Slaytlar gibi 4H gibi sert bir kalemle etiketli ve herhangi bir grafit toz kaldırmak için bir lateks eldiven ile "lekelenen" olmalıdır.
4. Daire içinde küçük bir hacim lizis tamponu yerleştirin.
5. Biyopsi blastomer lizis tamponu içine aktarın. Hücre lyse başlayıncaya kadar gerekli daire içinde lizis tamponu eklerseniz; hücre tamamen lyse ve sitoplazma tampon kurumadan dağıtmak.
6. Daire içinde kalır ve kayıp olduğunu sağlamak için çekirdeğin dikkat edin; hücre çekirdeğinde veya çoklu çekirdeklerin yoksa, başka bir hücreye biyopsi.
7. Slayt oda sıcaklığında kurumaya bırakın.

2 Tek bir blastomer Nucleus Situ Hibridizasyon

1. Steril distile su içinde yapılan etanol serisi (70, 90 ve% 100) hazırlayın.
2. Açın ve 75 için sıcak bloğu (örneğin Hybaid Omnislide veya Vysis Hybrite) ° C
3. Defrost probları, vorteks, santrifüj ve. Reaktifler tanık ve prob karışımı yapmadan önce doğru bir şekilde kontrol edilmelidir. Pipet 0.65 mL steril mikrosantrifüj tüp ve kullanımdan önce vorteks ve santrifüj prob karışımı telafi etmek için üretici tarafından belirtilen birimleri. Sondası karışımın toplam hacmi çekirdeği başına 2 mcL test ve bir güvenlik marjı izin için en yakın 10 mcL kadar yuvarlanır için yeterli olmalıdır.
4. Coplin kavanozlarda oda sıcaklığında 5 dakika. Kullanarak fosfat tamponlu salin (PBS) (0.14 M NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM KH ₂ PO ₄ pH 7.0) Ön yıkama slaytlar
5. Slaytları iki kez steril distile su ile durulayın.
6. Etanol serisi (70, 90, ve% 100) ile oda sıcaklığı ve hava-kuru her biri 2 dakika için slaytlar dehydrate. Emin olun slaytlar tam dalmış ve eğer herhangi bir yüzeye grafit toz yüzer, temiz bir mendil ile ıslatın.
7. Bir faz kontrast mikroskop ile görselleştirme daire içinde çekirdeğin konumunu kaydedin.
8. Oda sıcaklığında ve kuru hava az 2 dakika süreyle% 100 etanol ile dehydrate.
9. 2 mcL prob karışımı uygulayın ve 9 x 9 mm lamel (18 x 18 mm no.1 lamel dörtte biri) ile kaplayın.
10. Kauçuk çimento (İnek Prova örneğin İnek Sakız) ile lamel kenarlarında Seal.
11. 75 sıcak bir blok slaytlar Codenature ° C, daha sonra 5 dakika ve 37 nemlendirilmiş bir odasında (16-20 saat) bir gecede slayt melezleşme ° C. Sentromer probları (cinsiyete bağlı durumlar için yani) tamamen oluşur Probe karışımları melezleşme 60 dakika sonra tatmin edici bir sonuç verecektir.
12. 71 ile yeterli coplin kavanoz ve ısı ° C olan bir su banyosu hazırlayın
13. 0.4x standart tuzlu sitrat (SSC) sıkı bir yıkama çözeltisi (pH 7.0 az 71 ° C, 0.06 M NaCl, 6 mM _{C 6 H} 5 _{Na 3 O} 7 .2 H ₂ O) ve ısı su banyosu hazırlayın .
14. Coplin kavanoz başına sıkı yıkama 50 ml Uygulama ve sıcaklık 71 olup olmadığını kontrol edin ° C hemen temiz bir termometre kullanarak kullanmadan önce.
15. Her bir slayt kauçuk çimento dikkatlice çıkartın ve oda sıcaklığında% 4x SSC/0.05 Tween20 (pH 7.0) kullanarak lamel durulayın.
16. 71 0.4x SSC sıkı yıkama slaytlar yıkayın ° C, 5 dk. Coplin kavanoz başına fazla 6 slayt yıkayın.
17. 4x SSC/0.05% Tween20 slaytlar, oda sıcaklığında 2 dakika süreyle yıkayın.
18. Prob karışımı dolaylı etiketli prob (ler) varsa, aşırı sıvı kaydırağı boşaltma ve Parafilm bir 20 x 20 mm kare altında floresan konjuge antikor 20 mcL uygulayın.
19. 37 nemlendirilmiş bir odasında ° C'de 15 dk.
20. Parafilm çıkartın ve oda sıcaklığında 2 dakika süreyle% 4x SSC/0.05 Tween20 kez yıkayın.
21. 2 dakika süreyle PBS bir iki kez yıkayınt oda sıcaklığında ve slaytlar drenaj.
22. Hayır, 22 x 22 mm DAPI / Vectashield (4 160 ng ',6-diamidino-2-phenylindole dihidroklorür Vectashield montaj orta, Vector Laboratuvarlar 1 ml) 6 mcL uygulayın. 0 lamel ve lamel üzerinde slayt ters.
23. Leke ve şeffaf tırnak cilası ile lamel kenarlarında mühür.

3. Floresan Mikroskobu kullanılarak analiz uygun Kullanılan Problar için uygun filtreler ile donatılmıştır.

1. Bir floresan mikroskop ve tahlil her florokrom için tek bant-geçiren filtreler kullanılarak doğrudan görselleştirme Puan sinyaller. Her çekirdeğinde iki analistler tarafından atılırsa olmalıdır. Genel bir kural iki yakın aralıklı sinyaller daha az bir etki alanı dışında (sinyal genişliği) tek bir sinyal puanlama yol; ancak, deneyime dayalı kararı büyüklük, yoğunluk, değişik sinyaller ve ayırma yorumlamak olunması gerekmektedir.
2. Görüntüleme yazılımı kullanın (örneğin, İsis, MetaSystems, Altlussheim, Almanya; CytoVision, Genetix) görsel tanı onay için çekirdek bir görüntü yakalamak için, bir laboratuvar kalite güvencesi planının bir parçası olarak görüntü arşivleme için.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Metafaz ve interfaz çekirdekleri kültürlü periferik kan lenfositleri seçilen probları (subtelomere probları transloke segment ve sentromer probu (ler) merkezli sadece melezleşme kesmenoktaları için bilgilendirici, translokasyon kromozom için özel olduğunu onaylamak için muayene edilmelidir segment (ler)) ve interfaz çekirdekleri sinyalleri parlak ve ayrık olmalıdır. 100 interfaz çekirdeği her sonda her bir ortak işaretlerinin sayısı, puanlama testinin etkinliğini değerlendirmek için tavsiye edilir. Bu durumda 2 sinyal 95% -99% çekirdeğinin her sonda skorlandı. Şekil 1 kromozom 5 ve 9 kısa kolları arasında karşılıklı translokasyon için bir hazırlık metafaz ve interfaz çekirdeğinde gösterir.

Embriyonun blastomer interfaz çekirdekleri sinyaller parlak ve ayrık olmak ve kullanılan renkler için ayrı bir bant geçiren filtreler kullanılarak attı. Şekil 2 blastomer kromozom 5 ve 9 için normal ya da dengeli bir kromozom normal sinyal tutarlı bir deseni (test edilen tüm lokuslar için 2 kopya) ve anormal bir sinyal deseni ile translokasyon dengesiz bir ürün ile tutarlı bir çekirdek ile çekirdeği gösterir kromozom 5 ve kromozom 9 transloke segment için trizomi (3 nüsha) transloke segment için monozomi (bir nüsha).

Şekil 1 A metafaz yayıldı ve kısa kromozom 5 silah ve 5p14.3 ve 9p24.1 kesme noktaları ile 9 arasında bir karşılıklı translokasyon taşıyıcısı kültürlü periferik kan lenfositleri hazırlanan bir interfaz çekirdeğinde: 46, XY, t (5 9) (p14.3; p24.1) ish t (5, 9) (5ptel48-9ptel30 +; 9ptel30, 5ptel48 + 9cen +). FISH probları hem transloke segmentleri için seçilmiştir (5p14.3 → 5pter, kırmızı Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, yeşil Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) ve kromozom 9 merkezli segment (9p24.1 → 9qter, mavi Abbott CEP 9 alfa uydu SpectrumAqua).

Şekil 2 gün-3 embriyolar interfaz blastomer çekirdekleri. Sinyaller her florokrom ve kompozit bir görüntü oluşturmak için birleşti için farklı bir filtre kullanılarak ele geçirdi. (A), normal ya da dengeli translokasyon kromozomlar için bir tamamlayıcı ile tutarlı her lokus, iki nüsha gösteren her sonda için iki sinyal. (B) Bir kırmızı sinyal, üç yeşil sinyalleri ve 5. kromozomun transloke segmentinde bir kopyasını, komşu ile tutarlı kromozom 9 transloke segmentinde üç nüsha ve iki nüsha kromozom 9, merkezli segmentinde gösteren iki mavi sinyal 9p24.1 → 9pter 5p14.3 → 5pter ve trizomi monozomi dengesiz bir ürün olarak ortaya çıkan translokasyonu -1 segregasyon.