$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Hücre Kültürü ve Deneysel Set-up
- İnsan keratinositler keratinosit-SFM 15 mL (K-SFM) içeren 75 cm 2 doku kültürü şişeleri mono tabakaları olarak korunur, L-glutamin (2 mM), epidermal büyüme faktörü (5 ng ile desteklenmiş orta (Gibco, serum serbest orta ) / ml), sığır hipofiz ekstresi (40 mg / ml) ve 20 mg / ml gentamisin. Hücreler 37 ° C nemlendirilmiş bir% 5 CO 2 ortamında yetiştirilen
- Hücreler, 5 ml K-SFM orta içeren 12 x 25 cm 2 doku kültürü şişeler içine numaralı seribaşı .
Tek hücre süspansiyonları trypsinization tarafından hazırlanır. Hücreler, fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkanır ve 5-10 dakika için% 0.05 tripsin / EDTA çözeltisi ile inkübe edilir. Hücreler haline başladığınızda yuvarlak ve müstakil ~% 30,% 10 fetal sığır serumu içeren Dulbecco'nun modifiye kartal orta 3 cilt tripsin nötralize etmek için eklenir. Hücreleri (20 kez) yukarı ve aşağı pipetleme ayrılır. Hücreler hemasitometre kullanarak sayılır.
Uygun hücre sayıları iki katına zaman hücre hattı (insan FEP-1811 keratinositler için yaklaşık 20 saat) göre seribaşı. Amacı, deney günü ~% 90 confluency (şişesi ortalama ~ 10 6 hücre) elde etmektir .
12 şişe oluşan bir deney yaklaşık dört saat içinde tamamlanmalıdır tek bir clonogenic assay (altı ışınlanmamış kontrolü ve altı ışınlanmış şişeler) için en uygunudur.
2. Tedavi ve ışınlama
- Ilgili bir radyasyon değiştirerek bileşik uygun bir zaman için hücreleri tedavi ve hücreleri iyonize radyasyon γ-radyasyon veya X-ışınları ya maruz.
Genellikle altı şişeler, kaplama verimlilik (işlenmemiş) ve ilaç denetimlerin sadece olarak hizmet vermektedir. Diğer altı şişeler ışınlanmış.
1 saat suda eriyen bir doğal antioksidan formülasyonu, bu örnekte insan keratinositler Cinnulin PF çeşitli konsantrasyonlarda (20 mg / ml aşağıda gösterilmiştir temsilcisi veri; Dürüstlük Nutraceuticals Uluslararası, Spring Hill, TN, ABD CPF) ile tedavi edilir 37 ° C Hücreler 137 Cs kaynak (Nordion Uluslararası, ON, Kanada; 1.6 Gy / dk Gammacell 1000 Elite ışınlama) kullanılarak 4 Gy ışınlanmış.
3. Kaplama
- Daha önce açıklandığı gibi, tedavisi sonrasında, tek hücre süspansiyonları elde edilir.
- Her bir numune hücrelerinin sayısını dikkatli bir şekilde hemasitometre kullanarak, uygun hücre sayıları (beş 15 mm yemekleri her çoğaltır) petri kutularının içine numaralı seribaşı sayılır ve seyreltilir.
Plaka başına tohum hücrelerinin sayısını karar verirken kaplama verimliliği ve / veya fraksiyon hayatta tahmin edilmelidir. 150 koloniler - 20 arasında bir dizi amacı gerçekleştirmek için.
Petri kutularına nemlendirilmiş bir plastik klonlama kutusu olarak düzenlenmiş ve koloni oluşumu için 37 ° C,% 5 CO 2 ortamında inkübe .
Koloni oluşumu için inkübasyon süresi 1-3 hafta farklı hücre hatları için değişir, o zaman en az altı hücre bölünmeleri eşdeğer olması gerektiğini kabul edilir. Bu örnekte, insan keratinositler için kontrol yemekleri sekiz gün, 50 ya da daha fazla hücreden oluşan yeterince büyük klonlar formu gerektirir.
4. Tespit ve Boyama Kolonileri
Davlumbaz aşağıdaki adımları tamamlayın.
- Aspirasyon ile hafifçe plakaların her medya çıkarın.
- Her plaka 5 ml% 0.9 'luk tuzlu su ile yıkayın.
- 15-30 dakika için 5 ml% 10'luk nötral tamponlu formalin ile koloniler sabitleyin.
- 30-60 dakika dH 2 O 5 ml% 0,01 (w / v) kristal viyole ile Leke.
- DH 2 O ile aşırı kristal viyole yıkayın ve yemekleri kurumasını bekleyin.
5. Koloni Sayım
Stereomikroskopta
- 50 den fazla bireysel hücre içeren Kolonileri stereomikroskopta kullanarak sayılır.
Dijital görüntüleme ve görüntüleme yazılımı kullanarak sayma
- Kolonilerin Dijital görüntüler bir kamera kullanarak ya da cihaz tarama elde edilir
- Kolonileri aşağıda açıklandığı gibi görüntü analiz yazılımı paketleri kullanarak sayılır.
ImageJ (Fiji Sürüm 1.44a) kullanarak hücre sayımı
- Fiji görüntü dosyasını açın, Dosya -> Aç.
- > Ayarlayın ...-> Eşik görüntü 8-bit formatına dönüştürebilirsiniz Gerekirse, Görüntü gitmek.
- Böylece sadece koloniler tespit non-spesifik arka plan seviyesini düşürmek için eşik ayarlayın.
- Aşağıdaki kullanarak kolonilerin sayısı: Proses -> Binary -> maxima bul.
Bu görüntü formatı için, gürültü toleransı 0 olarak ayarlanır. O ışık arka plan seçeneği işaretli olduğundan emin olun vetespit maxima önizleme tüm hücre kolonileri doğru kayıtlı olup olmadığını kontrol edin.