Rezonans ve spontan Raman Microspectroscopy Floresan Arkaplan reddi

Özet

Biz ultrafast tüm optik anahtarlama floresan sinyallerine karşı Raman izole etmek için kullanan bir karmaşık doğrusal olmayan optik sistem inşası ve işletilmesi tartışacağız. Bu sistemi kullanarak, başarılı bir darbe enerjileri ve biyolojik olarak güvenli kalır ortalama yetkileri kullanan, Raman ve floresan sinyalleri ayrı edebiliyoruz.

Özet

Raman spektroskopisi, sık sık, özellikle biyolojik örnekler için, güçlü bir floresan arka plan boğulmuş. Hemen geç gelen floresan ışık Raman dağınık ışık gelen bir örnek, ultra hızlı bakliyat, zamansal zaman çizelgesi izole bir pikosaniye sinyalleri örtüşen Işıksal ayrı bir sistem bir tren ile heyecanlı. Burada Raman ve floresan sinyalleri izole etmek için, düşük güç optik Kerr kapı şeklinde tüm optik anahtarlama kullanan bir karmaşık nonlineer optik sistem inşası ve işletilmesi tartışacağız. <5 mW Raman saçılması heyecanlandırmak için örnek gönderilen 404 nm ışık dönüştürülen 808 nm ışık yaklaşık 200 mW, ortalama güç ve 80 MHz tekrarlama oranı 2,4 W ile tek bir 808 nm lazer ikiye bölünmüş durumda. Kalan dönüştürülmemiş 808 nm ışık daha sonra, tüm optik deklanşör pompa gibi davranır doğrusal olmayan bir orta gönderdi. Deklanşör yaklaşık% 5 'lik bir maksimum verimliliği ile 800 fs açar ve kapatır. Bu sistemi kullanarak, başarılı bir darbe enerjileri ve biyolojik olarak güvenli kalır ortalama güçleri kullanarak 80 MHz bir tekrarlama oranı Raman ve floresan sinyalleri birbirinden ayırmak mümkün. Sistem, optik güç açısından hiçbir yedek kapasite olduğundan, detaylı birçok tasarım ve hizalama konuları sisteminin verimini en üst düzeye yardım. Biz de içinde sinyal ve pompa kirişler Kerr orta mekansal ve zamansal örtüşme yanı sıra spektral edinimi için ayrıntılı bir protokol elde etmek için bizim protokol tartışmak. Sonuç olarak, zaman yolluk sistemi kullanarak güçlü floresan varlığında elde edilen Raman birkaç temsilcisi sonuçları raporu.

Protokol

1. Bazı bakım, bu sistem içinde bir Raman numune hazırlama ve yerleştirme alınması gerekmektedir.

1. Sistem genellikle çok kısa mesafelerde çok yüksek sayısal diyafram hedefleri kullanmak yapar, çünkü örnekler bir lamel üzerine yerleştirilir. Biyolojik numunelerin tipik bir Attofluor hücre odası (Invitrogen, Carlsbad, CA) monte No 1 kalınlığı lamel üzerine yerleştirilir.
2. Özellikle Sıvı numuneler, insanlar için toksik olan bir silikon epoksi sayesinde açılış çimentolu bir lamel ile küçük bir cam şişe konur. Şişe sonra ölçüm için ters çevrilir.
3. Bizim sistemi, pompa ve sinyal bakliyat hassas zamanlama bağlı olduğundan, biz hedefi yukarı ve aşağı çevirir mikroskop geleneksel odak ayarı, kullanmak için değil kısıtlanır. Bu ekler ve sistemi optik yol çıkarır. Bunun yerine, kendi bağımsız odak denetimi mikroskop sahne üstüne monte edilmiş ikinci aşama bizim örnekleri yer.

2. Zaman-kapılı Raman almak için, uyarma ışını düzgün hazırlıklı olmalıdır.

1. Sapph lazer (Chameleon, Tutarlı Sistemleri, Santa Clara, CA): 2.4 W ayarlanabilir darbeli Ti ortaya çıkan ışık ile başlar. Her bir atım, 80 MHz darbe tren, enerji 30 NJ 140 fs geçici bir genişliğe sahiptir ve 808 nm 'de merkezlenmiş ~ 6 nm spektral bant genişliğine sahip bir spektrum vardır.
2. Geri-yansımaları lazer boşluğu yeniden girmesini önlemek için, ışık Faraday izolatör geçirilir. Faraday izolatör önce yerleştirilen bir yarım dalga plakası sistemine gönderilen toplam güç sürekli ayar sağlar.
3. En Raman modları çözmek için çok geniş bir bant genişliği 6 mil olduğu için, kiriş, 808 nm merkezli bir (0.8 nm FWHM, Andover Corporation, Salem, NH) çok dar bir bant geçiren filtre ile gönderilir.
4. Işık daha sonra akromatik bir kristal (CASIX, Fuzhou, Çin Halk Cumhuriyeti), 808 nm, 404 nm dalga boyu yarıya 5 mm β-Baryum Borat (BBO) üzerine giyilen erkek yeleği (f = 100 mm) odaklanmıştır. BBO kristal bir bağlama ucu ve tilt kontrolleri ile yerleştirilir ve aynı zamanda bir çeviri aşamasında üzerine monte edilmiş. Dalga boyu dönüşüm verimliliği maksimize etmek için, kristal ikilisinin odak hakkında tam simetrik yerleştirilen ve kristal ekseni gelen ışının kutuplaşma hizalanmış olmalıdır.
5. Dalga boyu dönüşüm verimliliği kutuplaşma bağımlı olduğundan, örnek gönderilen ışık miktarı üzerinden kontrol Faraday izolatör sonra ikinci bir yarım dalga plakası koyarak elde edilebilir. Bu waveplate döner, örnek gönderilen ışık yoğunluğu şiddeti pompa ışın (aşağıda ele alınacak) gönderilen bağımsız olarak ayarlanabilir.
6. Dalga boyu dönüştürülür ışık çıkmadan ışını mikroskop objektif arka diyafram doldurmak için yeterince büyük ve ters bir mikroskobu (IX-71, Olympus, içine yönelik olduğunu gibi seçilen ikinci bir akromatik giyilen erkek yeleği (f = 500 mm) tarafından recollimated iki direksiyon aynalar vasıtasıyla Center Valley, PA).
7. Sistemin en monolitik bileşeni içinde barındıran optik eleman mikroskop objektif, optik ekseni tanımlar. Bu eksen uyarma ışın hizalamak için, bir ayna mikroskop örnek düzlemde yer almaktadır. Bir CCD kamera dönemi (μEye, IDS, Obersulm, Almanya) mikroskop görüntüleme bağlantı noktasına bağlı arka yansıtılan lazer ışını gözlemlerken iki direksiyon aynalar sonra iteratif ayarlanmış. Kamera görüntü mikroskop alan görüş merkezli olduğunu varsayarsak, ışın odak noktası, z-ekseni boyunca objektif, mikroskop çip ve çeviri üzerinde yoğunlaşmış-eksen merkez noktası değişmez odak dışı demetinin.
8. Bir örnek, örnek düzlemde yerleştirilir ve ışınlanmış zaman lazer ışığı Raman saçılması oluşur. Mikroskop objektif altına yerleştirilen bir dikroik filtre Raman dağınık ışık mikroskop yan port yönlendirme, uyarma ışın dalga boyu kaymıştır Raman dağınık ışık (floresan) ayırır. Mikroskop bu yolu içinde herhangi bir sinyal ışığı collimated mikroskop çıkar böyle lensler, kaldırmak için güncellenmiştir.
9. Mikroskop ortaya çıkan sinyal ışını Glan-thompson polarize açık diyafram daha büyük olduğundan, bir 0.47x teleskop iki akromatik çiftleri (f1 = 75 mm, f2 = 35 mm) inşa ışını küçültmek için kullanılır.
10. Sinyal, ışık daha sonra laboratuar çerçevesi dikey saygı ile 0 ° odaklı bir Glan Tekin polarize kutuplaşmış ve pompa ışını ile recombined bir dikroik ayna.

3. En yüksek verimle çalışması için optik kapısı için de pompa ışın (Kerr kiriş) hazırlanması, bakım alınmalıdır.

1. Pompa darbesinin ilk sinyal ışını nihai boyutuna uyacak şekilde iki akromatik çiftleri (f1 = 35 mm, f2 = 100 mm) ile yapılmış bir teleskop ile 0.35x tarafından büyütülür.
2. Pompa ışını sonra, pompa ve sinyal bakliyat (aşağıda ele alınacak ayarlama) zamansal örtüşme sağlamak için ayarlanmış olabilir doğrusal bir çeviri sahne üzerine yerleştirilen uygun bir prizma açısı oluşan bir gecikme hattına gönderilir.
3. Gecikme hattı sonra, ışın laboratuar çerçeve içinde dikey 45 ° odaklı bir yarım dalga plakası ve polarize yoluyla gönderilir. Doğrusal olmayan orta ulaştığında pompa ışın uygun kutuplaşma devlet sağlar.
4. Işık daha sonra iki direksiyon aynalar, ince pompa ışın konumunu ayarlamak için kullanılan bir piezo-elektrik kontrolleri, yansıyan sinyal ışını ile mekansal örtüşür. Üst üste iki ayrı yerde, biri yakın ve kirişler kombine dikroik ayna uzak bir pompa ve sinyal kirişler gözlemleyerek elde edilir. Yakın ve uzak noktada kirişler üst üste piezo ayna iki kirişler üst üste ilk direksiyon ayna kullanarak, pompa ışınının tam collinear sinyal ışını ile yapılabilir.
5. Iki ışın kombine toplanan zaman kapı sinyali en üst düzeye çıkarmak için, Kerr kapısı ve toplama sistemi kurulur.

4. Iki ışın kombine toplanan zaman kapı sinyali en üst düzeye çıkarmak için, Kerr kapısı ve toplama sistemi kurulur.

1. Pompa ve sinyal kirişler, doğrusal olmayan orta içinde, heyecan verici Raman saçılması herhangi bir kalıntı uyarma ışık önlemek için 404 nm dalga boyunda bir OD 6 bir dikroik filtre ilk geçirilir.
2. Pompa ve sinyal kirişler sonra her ikisi de bir akromatik doğrusal olmayan malzeme içeren bir 1 cm yollu kuvars küvet içine giyilen erkek yeleği (f = 35 mm) tarafından odaklı. Uygun bir yüksek doğrusal olmayan indeksi (CS ₂ daha yüksek) ve uygun kısa temporal yanıt (<2 bg) olan herhangi bir doğrusal olmayan malzeme, burada kullanılabilir. Bu deneyler için, doğrusal olmayan bir dizin n ₂ = 3.1 x 10 ^-18 m ² / W. karbon disülfit, CS _2, Işık daha sonra ikinci bir ilk özdeş bir odak uzaklığı ile elektronların ikili recollimated.
3. Kirişler sonra bir OD (10) 808 nm'de kombine olduğu emme ve girişim filtreleri bir dizi aracılığıyla sonra geçti ve dönen bir montaj Glan Tekin analizörü, ve.
4. Son olarak, sinyal, ışık, akromatik, lif, x, y ve z çeviri sağlayan bir sahne monte 50 mikron modlu fiber optik, içine giyilen erkek yeleği (f = 35 mm) tarafından odaklı Lif, daha sonra ticari bir görüntüleme spektrografla bağlı CCD kamera (SP2300i ve sırasıyla Pixis 100B, her ikisi de Princeton Instruments, Trenton tarafından üretilen, NJ) ile birleştirilmiştir.
5. Analizörü toplanan sinyali en üst düzeye çıkarmak için toplama sistemi hizalamak için, 0 ° ve toluen bir test örneği örnek düzlemde yerleştirilir. X, y ve z fiber montaj kontrolleri ayarlayarak, toplanan Raman sinyal optimize edilmiştir.
6. Pompa ve sinyal kirişler uygun mekansal ve zamansal örtüşme sağlamak için, bir ayna mikroskop örnek düzlemde yer alır. 404 nm filtre sistemden kaldırılır. Analizörü 90 döndürülmüş ° retroreflected 404 nm ışın yoğunluğu ile kamera doyurabilecek olmadığı gibi ayarlanabilir spektrografla içine gönderilir. Kapalı pompa ışını analizörü iletilen 404 nm sinyali en aza indirmek için döndürülür. Pompa ışını geri açıkken 404 nm ışık iletim artmaya başlayıncaya kadar, gecikme sahne yavaş yavaş ayarlanmıştır. Sonra, iteratif gecikme aşamasında, piezo-elektrikli ayna ayarlama, ve x, y ve z fiber kontrolleri, bir sinyalin en üst düzeye çıkarır.
7. 404 nm ışın ve Raman dağınık ışık sistemi ile biraz farklı yollar alabilir retro-yansıyan Çünkü, son ayarlamaları değiştirerek örnek sahne ve biraz ince ayar hizalama güçlü bir Raman Yorum; (örneğin, toluen gibi) koyarak yapılır gecikme aşamada, piezeo elektrikli ayna, ve fiber x, y ve z kontrolleri Raman sinyal optimize etmek.

5. Tek bir zaman-kapılı Raman spektrumu toplanması birkaç spektrumları edinimi, sistemi eserler düzeltmek için gereklidir.

1. 0 °, uyarma ışını ve kapalı pompa ışını analizörü ile, bir "ungated" spektrum zaman yolluk sistemi yararına olmadan kazanılmış olurdu spektrumu temsil alınır.
2. Analizör 90 °, uyarma kiriş ve pompa ışın hala kapalı olarak ayarlanmış bir arka zemin spektrum sisteminde polarize ve diğer unsurlar sızan sokak ışık miktarını temsil eden, alınır.
3. 90 kalan analizörü °ve tüm kirişler, pompa demetinin varlığı ile çapraz polarize üzerinden izin Raman dağınık ışık temsil eden "gated" spektrum alınır.
4. Son olarak, hala 90 ° analizörü ile, uyarma ışın ve pompa ışın, ikinci bir arka plan spektrumu spektrografla girerek 808 nm ışık kalıntı miktarları "geçitli" spektrum katkısını temsil alınır.
5. Ayrıca, kamera ve elektronik temel "karanlık" sinyal seviyesi karakterize bir spektrum, kapalı tüm lazerler ile alınır.
6. Yaygın bir sorun birkaç dakika açıklıklı üzerinden veri satın alırken spektrumları genellikle uzun entegrasyon süreleri gerektirdiğinden, bu kozmik ışınların düzgün bir şekilde düzeltilmesi için izin vermek için birkaç adet (kare) Bu entegrasyon süresi kırmak için zorunludur.

6. Kazanılmış sonra, birkaç işlem adımları verilerin kalite ve görünümünü iyileştirmek için faydalıdır.

1. İlk olarak, tüm spektrumları karanlık bir "karanlık" spektrum çıkarılarak giderilmiştir.
2. Kozmik ışınlar düzeltmek için, bir satın alma oluşturan birkaç kare piksel piksel olarak birbirleriyle karşılaştırılır. Tüm kareleri arasında o piksel için medyan değeri 2 medyan sapmalar dışında kalan herhangi bir çerçevenin herhangi bir piksel için, o pikselin değeri tüm kareleri arasında medyan değeri ile değiştirilir.
3. Daha sonra kozmik ışın düzeltilmiş kare ortalama ve Savitzky-Golay ^filtresi 1 yüzey düzeltilmelidir .
4. "Gerçek" geçitli spektrum ayıklamak için, ölçülen kapılı spektrumu "pompa sadece" spektrumları "uyarma yalnızca" çıkarma ve.
5. Son olarak, kapı ve ungated spektrumları sonra Lieber ve Mahadevan-Jansen ² yöntemi kullanılarak belirlenen 5 ^inci sipariş polinom çıkarılarak düzeltilmiş arka plan vardır.

7. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1. Kerr yolluk sisteminin şematik diyagramı. SHG yolu mavi ile yazılmıştır ise pompa ışın yolu, kırmızı renkte gösterilmiştir. Floresan zamansal filtre yolu sarı gösterilir Raman ve Floresans çakışan yol, yeşil gösterilir. Kısaltmalar aşağıdaki gibi: BPF, bant geçiren filtre, CCD, şarj çiftli aygıt; DCM, dikroik ayna; FI, Faraday izolatör; λ / 2, yarım dalga plakası; LPF, uzun-pass filtre; NLM, doğrusal olmayan orta, P, polarize SHG, ikinci harmonik üretimi kristal.

Şekil 2: immersiyon çözünmüş kumarin Ham spektrumları. Kırmızı eğri kapısı açık tutulan (analizörü maksimum iletim) ile alınan spektrum gösterir. Siyah eğri minimum iletim ve bir pompa ışın uygulanır (kapılı spektrum) hizalanmış analizörü ile alınan spektrum gösterir. Mavi eğri minimum iletim ve hiçbir pompa ışın uygulanan dizilen analizörü ile alınan spectum (kapı kapalı tutulan) gösterir. Yeşil eğri, sadece pompa ışın uygulanmış alınan spektrum gösterir. Kesikli kırmızı çizgiler aşağıda panelinde gösterilir spektral bölgede göstermektedir. Tüm spektrumları 11 puan, 3. sıra Savitzky Golay filtre ile düzeltti olmuştur. Alt: floresan arka plan çıkarma sonra immersiyon çözünmüş kumarin Spectra. Kırmızı eğri kapısı ile spektrum açık tutulan, ve mavi kapılı spektrum eğrisi. Kapılı spektrum yağların dolambaçlı wavenumber yüksek tepe özelliği açıkça gösterir.

Tartışma

Biyomedikal Raman spektroskopisi alanında biyolojik teşhis çok zor zorlukları çözmek için gösterdi potansiyel bir sonucu olarak son birkaç yıl içinde artan bir ilgi gördü. Örneğin, Raman kanser tespiti ^{3, 4, 5, 6} tanısal değeri olduğu gösterilmiştir. Raman spektroskopisi bakteriyel kantitatif ^{7, 8} ve bakteriyel ilaç yanıtı ⁹ da kullanılır olmuştur. Ayrıca kemik sağlığı ¹⁰ Biyolojik Akışkanlar analizi ^{11, 12} arasında değişen diğer biyomedikal uygulamalarda geniş bir ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Isim	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
Lensler	ThorLabs	Çeşitli	Her% 1 maksimum iletim kayıpları var kaplı tüm objektifler
Ayarlanabilir Ti: Sapph lazer	Tutarlı	Bukalemun	30 NJ, 200, fs, 80 MHz
40X yağ daldırma hedefi	Olympus	UApo/340	NA = 1.35
Ters mikroskop	Olympus	IX-71	Yan port tüm objektifler kaldırmak için Modifiye
Yarım dalga plaka	Thorlabs	AHWP05M-600
Glan-Tekin polarize	Thorlabs	GTH10M	~% 10 iletim kaybı
Spektrometre	PI Acton	SP2300i
CCD	PI Acton	Pixis 100B
Mathmatical yazılım	MathWorks	MATLAB	versiyon 2008a
Faraday izolatör	EOT	BB8-5I
Piezo-elektrikli ayna	Newport	AG-M100
BBO kristal	CASIX	özel	1 mm kalınlık
Bandpass 1	Andover	008FC14	808 ± 0.4 nm
Dikroik ayna	Semrock	FF662-FDI01	662 nm bant kenarı
Uzun-pass filtre	Semrock	BLP01-405R	417 nm bant kenarı
Bandpass filtresi 2	Semrock	FF02-447/60	417-447 nm
CS 2	Sigma-Aldrich	335266	% 99 saflıkta
Kumarin 30	Sigma-Aldrich	546127	% 99 saflıkta
Immersiyon	Cargille	16242	Tip DF