Bu protokolü açıklanan farelerde intraserebral kanama otolog kan enjeksiyonu modeli, iğne izi kadar kan reflü, pompa sistemi hiçbir antikoagülanlar riskini en aza indirmek için çift enjeksiyon tekniği kullanır ve sistemdeki tüm ölü boşluk ve genişletilebilir boru ortadan kaldırır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farelerde Spontan İntraserebral Kanama Model Otolog Kan Enjeksiyon
Bu makalede
Özet
Özet
İntraserebral kanama (ICH) sonrası yaralanmanın patofizyolojisinin incelenmesi, tekrarlanabilir bir hayvan modeli gerektirir. ICH, tüm inmelerin %10-15'ini oluşturmasına rağmen, hâlâ spesifik ve etkili bir tedavi yöntemi bulunmamaktadır. Farelerdeki otolog kan enjeksiyon modeli, insandaki spontan hipertansif kanamayı taklit ederek arteriyel kanın bazal ganglionlara stereotaksik olarak enjekte edilmesini içerir. Kanama sonrası yanıt bu şekilde in vivo olarak incelenebilir ve nörodavranışsal eksiklikler nicelendirilebilir; bu da ortaya çıkan patolojinin tanımlanmasına ve potansiyel terapötik ajanların test edilmesine olanak tanır. Bu protokolde açıklanan prosedür, kanın iğne yolundan geri kaçma riskini minimize etmek için çift enjeksiyon tekniğini kullanır, pompalama sisteminde antikoagülan kullanmaz ve sistemdeki tüm ölü hacmi ve genişleyebilir tüpleri ortadan kaldırır.
Protokol
1. Ekipmanların hazırlanması
- Bakteriyel kontaminasyonu en aza indirmek için,% 75 etanol ile stereotaksik çerçeve ve pompa aşağı doğru silin.
- Hamilton şırınga ve erimiş silika iğne sterilize edin.
Not: Eğer kimyasal sterilizasyon kullanılır, kullanmadan önce steril su ile birkaç kez durulama emin olun. - % 75 etanol ile parafin kağıt yüzeyi silin ve kurumasını bekleyin.
2. Enjeksiyon için fare hazırlanması
Not: fareler var, onlara yeni bir çevre gelmesini ve stresi azaltmak için izin hayvan tesis ameliyattan önce en az 7 gün teslim.
- Ameliyat öncesi bazal için fare tartılır.
- Tepkisiz kadar kuyruk tutam İsofluranın% 30 Oksijen,% 70 oksit ve% 4 ile anestezi neden
- Post-operatif analjezi için buprenorfin 0.1mg/kg intraperitoneal fare enjekte
- Kafa derisi Tıraş
- Steril vazelin ile Coat gözleri
- Betadin x 3 mendil ile kafa derisi hazırlayın, sonra kafa derisi kurumasını bekleyin
- Kafa derisi steril cerrahi neşter kullanılarak 1 cm orta hat sagittal kesi
Not: cömert bir kesi kafatası yerlerinden tam maruz sağlayacaktır. - Tabanından başlayan kuyruk 1 cm ventral yüzeyinin 1 cm Tıraş ve betadin x 3 mendil hazırlamak
- Stereotaksik çerçeve yerleştirin fare
Not: fare mükemmel bregma bregma sağ kalma ve en az 3 mm, çerçeve tabanı ile kafatası paralel yüzeyi ile çerçeve güvenli sağlamak için önemlidir.
3. Intraserebral kanama ameliyatı
Notlar: tüm ameliyat boyunca sürekli 37 muhafaza İsofluranın% 30 Oksijen,% 70 oksit ve% 1-3, fare ile anestezi ± 0.5 ° C termistör kontrollü ısıtma yastığı ve rektal termometre ile izlenir.
- 1 cc şırınga çerçeve üzerinde steril 27 g iğne takın.
- Stereotaksik kol tam bregma yerinde iğne kadar ayarlayın.
- Bu iğne 2,5 mm kafatası yüzeyine bregma lateral ve alt böylece kol ayarlayın.
- El tamamen kafatası delinecek çerçeve dikkate alarak hafif aşağı yönlü hareketi uygularken kafatası yüzeyinde burr hole şırınga döndürün.
- Şırınga / iğne ile iğne ve tam burr hole elle çıkarın
Not: Eğer kafatası ve beyin parankimi içine iğne yanlışlıkla itme riski en aza indirir iç tablo delikli varken el ile burr hole tamamlanması hemen tanınması için izin verir. - , Steril cerrahi bıçak kullanarak kuyruk ventral yüzeyinde enine kesi yapın ve arteryel kan 2-3 büyük damla parafin kağıt üzerine düşmesine izin. Sonra hızlı bir şekilde steril gazlı bez kullanarak basıncı ile kanamayı durdurmak.
- 17 mcL kan Hamilton enjektör ve pompa üzerinde yer şırınga içine çekin.
- Point 5 stereotaksik kol ayarlayın ° dikey eksen mediale göreceli.
- Bu iğne ucu kafatasında burr hole üzerinde ve daha sonra alt iğne 3,5 mm kadar dikkatle stereotaksik kol ayarlayın.
- 2 dakika sonra 0.5 mm iğne geri bekleyin (böylece ucu derin 3 mm)
- Beyin iğne etrafında yeniden genişletmek ve enjeksiyon sırasında iğne ekleme parça geri kaçmasını kan riskini en aza indirmek için 5 dakika bekleyin.
- 7.5 mcL kan 1 mcL / dakika enjekte edilir.
- Ilk kan pıhtılaşması izin ve doku vardiya, intrakranial basıncı yükselmeleri en aza indirmek için meydana 5 dakika bekleyin.
- 1 mcL / dakika kalan 7.5 mcL enjekte
- Iğne, kan pıhtılaşması için izin vermek için 25 dakika boyunca yerinde kalması için izin verin
Not: Başarısızlık, kan pıhtılaşması, kan iğne ekleme sitesi reflüye neden olacaktır iğne çekilirken beklemek - Yavaş yavaş geri çekilmesi ve iğne iğne herhangi bir kalıntı kan pıhtılaşma önlemek ve iğne tekrar kullanılabilirliği sağlamak için derhal sıcak su ile durulayın.
- Çerçeveden çıkarın ve fareyi, veteriner cerrahi yapıştırıcı ile kuyruk ve kafa derisi kesiler yakın.
- Anestezi kapalı açın.
- Sürekli gıda nemlendirilmiş için ücretsiz erişim ile ısındı olurken uyandırmak için fare izin verin.
- Littermates tamamen uyanık kafes fare dönün. Gıdaya erişim hayvanlara yardım etmek için kafesin altındaki ıslak gıda pelet yerleştirin.
4. Temsilcisi sonuçları:
Şekil 1. Koronal bölümünde, 15 dakika ICH cerrahi sonra fare beyin . Hemen sonra kurban beyin iğne ekleme yerinde bir koronal bölümünde brüt muayene dayalı ICH başarısı için denetlendi. Korpus kallosum geçmiş, ya da ventriküller içine iğne izi kadar, beyin tabanına paletli kanamalar başarısız sayılır ve o fare tüm analizler elendi. Genel ICH success oranları% 0 mortalite ile 50 farelerde% 75-85 idi.
Şekil 2 Silindir test sağ bazal ganglion ICH sonra sol hemiparezi göstermektedir. ICH cerrahi sonrası (A) Örnek fare arkada. Sadece sağ ön ayakları, sonra sol bazal ganglion ICH silindir duvara yerleştirilmesi unutmayın. (B) silindir test grafiği sonra farelerin kohortta 1 sonuç ICH cerrahi (n = 5) sahte karşılaştırıldığında (n = 4). Şam farelerin kan enjeksiyon (iğne beyin içine yerleştirilmiş) dışındaki tüm prosedürler vardı. Her fare, 12 cm çapında açık cam silindir yerleştirilir ve 20 rears gözlendi. Silindir duvara ön ayakları ilk yerleşim arka ortalama gol oldu. Fare yere geri döndü ve sonraki arka puan kadar daha sonraki hareketleri (yanal arama gibi) gol değildi. 0 hiçbir ön ayakları tercihi ve 1 sadece sağ ön ayakları nerede, (# + # sağ sol + # iki) / - lateralite indeksi olarak hesaplanır (silindir tarafında # # ön ayakları yerleşimleri sol sağ ön ayakları yerleşimleri) .
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Intraserebral kanama, spontan bazal ganglia kanama tekrarlanabilir bir model otolog kuyruk arter kan sonuçlarını kullanarak farelerde Bu cerrahi modeli. Farelerde bir ICH modeli patofizyolojisi araştırmak amacıyla transgenik hayvanların durumu avantaj sunar; Ancak, bunların küçük boyutlu büyük hayvanların daha nöroşirürjikal işlemler teknik açıdan daha zor hale getirir.
Kollajenaz model ve otolog kan enjeksiyonu modeli deneysel ICH iki köklü modelleri. Kollajenaz modeli daha kolay bir prosed...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu iş, Translasyonel Tıp ve Tedavi Enstitüsü dostluk ve Pennsylvania Üniversitesi ve Marlene L. Cohen ve Jerome H. Fleisch Scholar Grant, Tıp ve Mühendislik (T32HL007954) Enstitüsü eğitim bursu tarafından finanse edildi Connecticut Üniversitesi Sağlık Merkezi (LHS) ve NIH NS-029.331 (FAW).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
Stereotaksik fare nöroşirürji için bir çerçeve (Stoelting, 51.925)
Mikroinfüzyon pompa ve işlemci (UMP-3 ve Micro4, Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL)
Fare sıcak (Stoelting, 50300)
İnhalasyon fare anestezi (Braintree Bilimsel, EZ-AF9000)
25 mcL gaz geçirmez borosilikat Hamilton kaplı piston enjektör ve herhangi bir iğne
(Hamilton şirket, Reno, NV, 1702RN şırınga: 765.401, halkalı: 30.949, mesafe: 30.946)
erimiş silika iğne, 2 cm uzunluğunda (Hamilton, 17739) kesilmiş
* Not Hamilton şırınga ve erimiş silika iğne eğer her ameliyat öncesi sterilize birden fazla ameliyatları için yeniden olabilir. Bu malzemeler, kan pıhtılaşmasını önlemek için çok önemlidir.
Steril cerrahi eldiven
Cerrahi önlük, bone ve maske
Betadine
% 75 etanol
steril 27 g iğne (tek kullanımlık)
steril 1 cc şırınga (tek kullanımlık)
steril cerrahi bıçak
Cidex
steril su
buprenorfin ve izofluran
steril gazlı bez
parafin kağıt kareler
Veteriner cerrahi yapıştırıcı (Vetbond, 3M, St Paul, MN)
Kaynaklar
- Hua, Y., Schallert, T., Keep, R. F., Wu, J., Hoff, J. T., Xi, G. Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat. Stroke. 33, 2478-2484 (2002).
- James, M., Warner, D., Laskowitz, D. Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective. Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).
- Foerch, C., Arai, K., Jin, G., Park, K. -P., Pallast, S., van Leyen, K., Lo, E. H. Experimental Model of Warfarin-Associated Intracerebral Hemorrhage. Stroke. 39, 3397-3404 (2008).
- Nakamura, T., Xi, G., Hua, Y., Schallert, T., Hoff, J. T., Keep, R. F. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 487-494 (2004).
- Rynkowski, M. A., Kim, G. H., Komotar, R. J., Otten, M. L., Ducruet, A. F., Zacharia, B. E., Kellner, C. P., Hahn, D. K., Merkow, M. B., Garrett, M. C. A mouse model of intracerebral hemorrhage using autologous blood infusion. Nat. Protocols. 3, 122-128 (2008).
- Wang, J., Fields, J., Doré, S. The development of an improved preclinical mouse model of intracerebral hemorrhage using double infusion of autologous whole blood. Brain Research. 1222, 214-221 (2008).
- Zhao, X., Sun, G., Zhang, J., Strong, R., Song, W., Gonzales, N., Grotta, J. C., Aronowski, J. Hematoma resolution as a target for intracerebral hemorrhage treatment: Role for peroxisome proliferator-activated receptor γ in microglia/macrophages. Annals of Neurology. 61, 352-362 (2007).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
