Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

Özet

MACS ve Annexin V-konjuge manyetik boncuk ve hedef lipid ve Annexin V-bağlayıcı fosfatidilserin sentezlenen lipid veziküller hedef lipid protein etkileşim test etmek için. Ortak hedef lipid bağlı Proteinler saflaştırılmış ve boncuk elüsyon sonra analiz edilir.

Özet

Lipidler çoğu arıtma prosedürleri erişilemez duruma, bu nedenle hücre zarlarında gömülü ve çünkü lipid protein etkileşim analizi zordur. Alternatif olarak, lipidler, lipid ELISA ve Plazmon rezonans spektroskopi için kullanılan gibi düz yüzeyler üzerinde kaplı olabilir. Ancak, yüzey kaplama lipidler, lipid bağlayıcı özellikleri için önemli olabilir microdomain yapılar oluşturmak yok. Ayrıca, bu yöntemleri, hedef lipidler bağlayıcı proteinlerin büyük miktarlarda arıtma için izin vermez.

Lipid protein etkileşim test bu sınırlamaları aşmak ve lipid bağlayıcı proteinlerin arındırmak için manyetik aktive hücre sıralama (LIMACS) kullanarak lipid vezikül aracılı afinite kromatografisi olarak adlandırılan yeni bir yöntem geliştirdi. Bu yöntemde, lipid veziküller Annexin V MACS çapa lipid olarak hedef lipid ve fosfatidilserin ile hazırlanmıştır. Fosfatidilserin protein Annexin V. fosfatidilserin içeren lipid veziküller manyetik boncuk bağlamak Annexin V konjuge manyetik boncuklar kullanarak yüksek afinite gösteren her yerde bulunan bir hücre zarı fosfolipid. Hedef lipid bağlayıcı protein, lipid veziküller lizat bir hücre ile inkübe edilir boncuklar bağlı olacak ve MACS kullanarak ortak arındırılmalıdır. Bu yöntem ayrıca test etmek için kullanılır rekombinant proteinler sulandırmak hedef lipid bağlayıcı bir protein kompleksidir.

Biz sphingolipid seramid ve co-purify prostat apoptozis cevabı 4 (PAR-4), seramid ilişkili aPKC için bağlayıcı bir protein atipik PKC (aPKC) etkileşimi göstermek için bu yöntemi kullanmıştır. Ayrıca hücre polarite ilgili proteinler Par6 ve Cdc42 rekombinant aPKC seramid ile ilişkili kompleks sulandırıldıktan için bu yöntemi kullanmıştır. Lipid veziküller sphingo-veya fosfolipitler çeşitli hazırlanmış olabilir, hücre zarından yakından benzer bir lipid ortamda LIMACS lipid-protein etkileşim için çok yönlü bir test sunuyor. Ek lipid protein kompleksleri lipid bağlayıcı protein, lipid veziküller ile birlikte arıtılmış proteomik analizi kullanılarak tespit edilebilir.

Protokol

1. Giriş

Manyetik aktive hücre sıralama (LIMACS) tekniği kullanılarak lipid vezikül aracılı afinite kromatografisi ^1-3 seramid ile ilişkili protein kompleksleri izole etmek için laboratuvarda geliştirilmiştir. Başlangıçta, lipid veziküller manyetik partikül konjuge Annexin V (fosfatidilserin için son derece ilgin) kullanarak MACS veziküller ve ilişkili proteinler izole etmek için izin seramid ve fosfatidilserin yapılmıştır. Seramid ile ilişkili bir polarite karmaşık ve seramid-bağlayıcı proteinlerin hücre izolasyonu in vitro sulandırıldıktan ³ lizatları LIMACS tekniği kullanılmıştır. LIMACS veziküller (örneğin, glikolipid specifc lektinler veya lipid antikorlar) izolasyonu için diğer etkileşim ortaklarını kullanarak değiştirilebilir.

2. Deneysel Prosedürler

Lipid Veziküller hazırlanması ve aPKCBinding Tahliller

1. Lipid veziküller fosfatidilserin (105 mikrogram) ve büyük lipozom hazırlama ^1,4-7 için modifiye işlemleri takiben C16-seramid (85 mikrogram) ekimolar miktarda kurutulmuş karışımlar elde edilir.
2. Lipid karışımları sonra yeniden süspanse ve 1 saat 50 mM Tris / HCl (pH 7.5) ve 150 mM NaCl içeren vezikül tampon 100 ul sonicated.
3. 0.1 mM MnCl ₂ ile desteklenmiş vezikül tampon 300 ul ekledikten sonra, örnekleri, 4 20 dakika 12.000 μ g ° C santrifüj
4. Pelet (büyük lipid veziküller) 100 ul vezikül tampon yeniden bekletildi ve 37 az 1 saat süreyle Vybrant CM-DII 1 nmol ile inkübe ° C MACS ayrılıktan sonra vezikül fraksiyonu görselleştirmek. Vybrant CM-DII özellikle lipid membranlar içeren kırmızı bir floresan boya.
5. Deterjan ücretsiz cep lizat santrifüj membranöz enkaz kaldırma hipotonik tampon (proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile 10 mM Tris / HCl (pH 7.0)) 300 ul sonication / hücre homojenizasyon hazırlanmıştır. 1 saat için 100.000 xg'de santrifüj adım fosfatidilserin içeren endojen membran ile hücre lizat kirlenmesini önlemek için ilave edilmelidir.
6. Temizlenir lizat lipid vezikül süspansiyon eklenir ve karışım 4 ° C'de 2 saat inkübe
7. Reaksiyon karışımı, 20x Annexin V bağlayıcı Annexin V konjuge manyetik boncuklar içeren bir çözüm tampon ve 50 ul 20 ul ile desteklenmiş 1 saat 4 ° C inkübasyon takip
8. MACS üreticinin (Miltenyi Biotec, Inc.) Protokolü göre yapılır. Mikroplaka floresan okuyucu kullanarak akış yoluyla ve elüsyon kesirler Vybrant CM-DII floresan izlenmesi lipid veziküllerin varlığı ve miktarı tarafından belirlenir.
9. Veziküler lipit miktarı ve floresan yoğunluğu arasında doğrusal bir ilişki vezikül bağlı Vybrant CM DII Annexin V-MACS uygulanan lipid karışımı kantitatif yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi (HPTLC) tarafından doğrulanmadı.
10. Seramid / fosfatidilserin veziküller aPKC veya diğer proteinleri bağlama reaksiyon özgüllüğü 1 saat 4 ° C inkübasyon öncesinde hücre lizat inkübe 1 mikrogram anti-PKCζ tavşan poliklonal antikor kullanarak bir antikor yarışma yöntemi ile doğrulanır lipid veziküllerin.
11. MACS eluat seramid / fosfatidilserin veziküller bağlayıcı protein, SDS-PAGE ve immunoblotting tarafından analiz edilir.

In vitro lipid-protein polarite kompleksi

1. In vitro lipid-protein polarite kompleksi sulandırıldıktan, önceki bölümde açıklandığı gibi LIMACS prosedürü izleyerek yapılır . Kısa, fosfatidilserin (420 mikrogram) ve C16-seramid (107 mikrogram), organik çözücü kurutulur.
2. Kurutulmuş lipidler ul vezikül tampon 500 (150 mM NaCl, 50 mM Tris / HCl, pH 7.5) sonication altında yeniden süspanse.
3. 10 mM MnCl2, 1 ul Vybrant CM-DII ve PKCζ, 500 ng (insan rekombinant) Beş ul eklenir ve reaksiyon karışımı 4 undergentle ajitasyon 60 dakika inkübe edilir ° C
4. Vybrant CM-DII lekeli fosfatidilserin / seramid veziküller 60 dk 4 ° C 12.000 xg'de santrifüj tarafından kurtarıldı
5. Pelet (pembe) 100 ul Tris tamponu yeniden süspanse ve γS-GTP (100 mcM), GSYH (1 mM), GST-Par6 (100 ng), ya da GST-Cdc42 (500 ng) ile desteklenmiş ve daha 3 inkübe 4 h ° C (ilgi rekombinant proteinlerin başka herhangi bir kombinasyonu kullanılabilir).
6. Annexin V-tampon (20x stok solüsyonu 5 ul) ve Annexin V-konjuge manyetik boncuk (50 ul) eklenir ve reaksiyon karışımı yavaşça sallanarak başka bir 30 dakika 4 ° C'nin altında inkübe
7. Annexin V-MACS tedarikçinin protokolü daha önce açıklandığı gibi yapılır.
Elüsyon fraksiyonu (1 ml), 10 mikrogram ile yağış yardımcı olarak saf ovalbumin tamamlanmaktadır. Protein Wessel-Flugge yağış konsantre ve daha önce ⁸ açıklandığı gibi SDS-PAGE/immunoblotting tarafından analiz edilir.
8. Wessel Flugge yağış reaksiyon organik (kloroform / metanol) aşamasında Vybrant CM-DII (pembe) tespiti ile yıkandı, lipid veziküllerin miktar miktarı. Analiz protein miktarı eşit miktarda lipid veziküllerin normalize.

3. Sonuçlar

LIMACS PKCζ-EGFP arıtma ve seramid bağlayıcı etki alanı C20ζ-EGFP

Tam uzunlukta ifade MDCK hücreleri bir deterjan içermeyen lizat PKCζ C-terminal, yeşil floresan protein (FLζ EGFP) veya PKCζ (C20ζ-EGFP) C-terminalindeki bir seramid bağlayıcı etki alanı bağlantılı fosfatidilserin / seramid veziküller ile inkübe Deneysel Prosedürler nitelendirdi. MACS sütun elüsyon sonra, protein tespiti için yıkandı, protein ² PKCζ ve EGFP immunoblotting ve karşı antikorlar kullanılarak analiz edildi.

Şekil 1 LIMACS EGFP-etiketli PKCζ ve C-terminal parçası C20ζ fosfatidilserin / seramid veziküller.

Deneysel Usul bölümünde açıklandığı gibi, EGFP (bağlayıcı olmayan bir kontrolü gibi), tam uzunlukta PKCζ-EGFP veya seramid bağlama, C-terminal parçası C20ζ-EGFP ifade MDCK hücreleri Deterjan lizatları fosfatidilserin / seramid veziküller ile inkübe edildi. . LIMACS kullanarak sonra, protein, SDS örnek tamponu ile yıkandı, ve SDS-PAGE ile analiz ve immunoblotting. Sol panelinde EGFP Annexin V bağlantılı manyetik boncuk muhafaza veziküller bağlamak olmadığını gösterir. Orta ve sağ panelde o tam uzunlukta PKCζ-EGFP C20ζ-EGFP seramid için bağlayıcı nedeniyle tutuldu.

Tartışma

Hücre zarında lipid gömerek bir lipid ve bağlayıcı protein arasında belirli bir etkileşim test etmek için bir engel teşkil etmektedir. Hücre zarı, birkaç lipitleri ve proteinleri karışımından oluşur ve lipid microdomains veya sallar düzenlenmiştir. Bu nedenle, bir protein, lipid doğrudan bağlar ya da sadece bir microdomain yapısı zenginleştirilmiş microdomains ve proteinlerin ortak arıtma açıkça ayırt edemez. Lipid ELISA'larla veya Plasmon rezonans spektroskopi gibi yüzeyleri kaplanmış tanımlanan lipidler kullanan d...

Malzemeler