2-foton Mikroskop kullanarak Enfekte Akciğerler Nötrofiller Fagositoz ve NET-oluşumu Doğrudan Gözlem

Özet

Biz patojenleri fagosite veya nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NET) üretirken enfekte akciğerlerde nötrofil granülositler dinamiklerinin gözlem için 2-foton mikroskopi nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Özet

Gastrointestinal sistem, akciğer, omurgalı vücut ve çevre arasındaki etkileşim için en büyük ikinci yüzey. Burada, aynı zamanda, normal solunum sırasında inhale birden fazla patojenlerin enfeksiyon kaçınarak etkili bir gaz alışverişi, bakımlı olmalıdır. Bunu başarmak için, savunma stratejileri, humoral ve hücresel immün mekanizmaları birleştirerek mükemmel bir set var. Akut akciğer savunma için en etkili önlemlerden biri ya da inhale patojenleri fagosite veya sitotoksik kimyasalların serbest bırakarak onları öldürmek nötrofil, işe alım. Nötrofil cephanelik için yeni bir ek bakteri veya mantar yakalanan veya inaktive NET serbest hücreleri öldü sonra bile olabilir ekstrasellüler DNA NET'ler patlayıcı sürümüdür. Biz, burada kısa bir süre önce enfekte akciğer içinde göç yanı sıra enfekte doku boyunca ürettiklerini geniş NET'ler görselleştirmek gibi fungal patojenlerin phagocytosing nötrofil biri doğrudan gözlemlemek için izin veren bir yöntem mevcut. Bu yöntem, çok renkli zaman atlamalı 2-foton mikroskopi kalıp Aspergillus ve sınav konidya ile farelerin intratrakeal enfeksiyon 7 saat sonra, kalın yaşayabilir akciğer dilimler hazırlama açıklamaktadır. Bu yaklaşım, bir doğrudan yerli akciğer dokusunda antifungal savunma araştırmak için izin verir ve böylece pulmoner dokunulmazlık ayrıntılı soruşturma için yeni bir caddeye açılır.

Protokol

1. Enfeksiyon

1. Şişmiş konidya küf Aspergillus (suşu ATCC 46.645) ile desteklenmiş RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlin, Almanya) ön-inkübasyon tarafından üretilen% 5 FCS (v / v). 2x10 ⁷ dinlenme konidya 5 ml ortamda yeniden süspanse ve 6-iyi doku kültürü plakası (DYP AG; Trasadingen, İsviçre, katalog # 92.006) inkübe 37 ° 7h ° C
2. 6-iyi de içeren her Aspergillus; şişme döneminin ardından, sporlar floresan calcofluor beyaz stok solüsyonu (DMSO [25 mg / ml] Sigma Aldrich, Deisenhofen, Almanya, katalog # F3543) 10 ul ekleyerek etiketlenir plaka, son bir calcofluor konsantrasyonu 50 mcg / ml RPMI ulaştı. Nazik karıştırma, sporlar, 37 ° C'de 15 dakika ek bir inkübe
3. Bir sonraki adımda, sporlar, 70 mikron hücre süzgeç (BD Biosciences, Heidelberg, Almanya) ile filtrasyon ile hasat edilir. Pelet 2 ml PBS ve şişmiş Konidyumların Neubauer odasına sayma tarafından belirlenen toplam sayısı 10 ml PBS (oda sıcaklığında 5 dakika 900xg santrifüj) ile bir kez yıkadıktan sonra yeniden süspanse. Son olarak, spor süspansiyon, oda sıcaklığında 5 dakika 900xg aşağı bükülmüş, süpernatantı dikkatle kaldırılır ve pelet nihai konsantrasyonu 100 ul PBS başına 1x107 sporları için yeniden süspanse.
4. Enfeksiyon, spor çözüm ul dişi farelerde (C57/BL6, eski 8-10 hafta, Harlan, Almanya) 100 intratrakeal uygulanır. Nötrofillerin yanı sıra dikkat edilmesi gereken ise, lizozim Promotor ¹ altında EGFP taşıyan Lys-EGFP farelerin kullanımı tavsiye edilir. 150 ul Ketamin / Rompun çözüm (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Almanya (Ketamin) ve Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Almanya (Rompun), 1 ml Ketamin [50 mg / ml] başlayın hayvan tek bir IP enjeksiyonu ile anestezi + 0.5 ml Rompun% [2] + 3.5 ml steril NaCl [% 0.9]). 5 dakika sonra anestezi fare dişleri entübasyon (ek Şekil 1) kolaylaştırmak için rampa (yani bir eğimli yüzey) elastik bir bant ile sabit olabilir. Forseps kullanarak, dil, tek taraflı ve 22G kalıcı venöz kateter (B. Braun AG, Melsungen, Almanya, Vasofix Braunüle) hafifçe kalıcı bir kaz boyun lamba ile aydınlatma altında trakea içine eklenebilir çekilir. Kateterin başarılı ekleme, mekanik ventilatör frekans hayvanın göğüs kafesi düzenli hareketlerini izleyerek tarafından doğrulanmadı. Başarılı entübasyon onaylandığı zaman, 100 ul spor süspansiyon, 100 ul mikropipet kullanılarak uygulanır. Bu ses 1-2 sn içinde herhangi bir ek yardım almadan hayvan tarafından inhale edilmelidir Mekanik olarak 2 dakika boyunca dakikada 250 nefes oranı ve 300 inhalasyon hacmi küçük bir hayvan respiratör (MiniVent Hugo Sachs, Mart-Hugstetten, Almanya) ile enfekte hayvan havalandırarak mantar parçacıkları, akciğer içinde gelişmiş bir dağıtım elde edilir ul nefes başına (ek Şekil 2). Enfeksiyon hayvanlar kendi kafesine geri döndü ve tekrar ayaktan kadar her 5 dakikada bir gözlenen sonra. Fare aşağıdaki kuluçka dönemi sırasında ağrı veya sıkıntı herhangi bir kanıt yoktur.

2. Akciğer hazırlık

1. Sporlarla birlikte enfeksiyon 7 saat sonra, hayvanın aşırı dozda tarafından ötenazi izofluran (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Almanya) hareketleri ve solunum 30 saniyeden fazla durdurdu kadar. Bu daha sonra, ikincil bir yöntem olarak klinik ölüm sağlamak ve görselleştirme ve trakea ve akciğerler erişim için izin torakotomi takip edilmektedir. Sonra göğüs, akciğer ve üst solunum yolu açığa çıkarmak için dikkatle açıldı. Sonra başka bir 22G kalıcı venöz kateter maruz epiglot başlayarak trakea içine sokulur. Bu borucuk aracılığıyla akciğerlere 1 ml Omnifix şırınga (B. Braun) ile 1 ml önceden ısıtılmış düşük erime agaroz (2% w / v, Promega, Mannheim, Almanya) ile doldurulur. Trakea, akciğerler dolu olarak kısa bir parça dikiş ipliği ile bağlıdır ve tüm hayvan 4 bir buzdolabı koymak ° C.
2. 15 dakika sonra, agaroz katılaşmış, tüm akciğer, trakea itibaren eksize edilir. Bir çift sivri makas kullanarak, sağ akciğer lob daha sonra kaldırılır, alt yüzeyi kısa süre içinde bir yaprak kağıt mendil kurutulur ve daha sonra tüm lob vibratome (Chipping Instruments, İngiltere, 752M Vibroslice hazırlanması blok yapıştırılmış ) fiksasyon için doku yapıştırıcısı (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Almanya, Roti-Coll 1) bir damla. 1 dakika sonra blok önceden soğutulmuş (4 ° C) PBS ile doludur vibratome, kesme odasında yüklenir. Vibratome orta sınıf bir titreşim (10 max 5) ve aynı zamanda orta hızı (5, 10 max.) Böyle bir yatay kesitiakciğer üretilmektedir. Organ üst yarısında daha sonra, bir dizi paralel naylon konuları kapsadığı Kendi kendine yapılan bir düz rondela (iç çapı 1 cm) ile ters ve sabit bir küçük plastik Petri kabı (5 cm çapında), aktarılır dışında her 1 mm (tamamlayıcı şekil 3). Son olarak Petri kabı 10 ml PBS ile desteklenmiş 10 ul DNA boya Sytox Turuncu 5 mcM son bir boya konsantrasyonu [5 mM] (Invitrogen, Almanya) ile doludur.

3. 2-foton lazer mikroskopisi

1. Akciğer örnek içeren Petri kabı sonra tampon bir sıcaklık sensörü kontrollü ısıtıcı (ek Şekil 4) ile 37 ° C ısınmış olabilir, böylece mikroskop objektif altında yüklü. 2-foton mikroskopi sonra 20xNA1.0 suya daldırma lens (Zeiss Jena, Almanya) ile donatılmış bir dik Axio Examiner sahnede Zeiss LSM 710 NLO mikroskop kullanarak tüm kesim yüzeyi üzerinde gerçekleştirilir. Görüntüleme için, bölüm boyunca farklı alanlarda tespit yeşil (530 nm) ve kırmızı (580 nm) floresans yanı sıra, ikinci harmonik üretimi (SHG) sinyal ve 800 nm dalga boyunda bir aydınlatma ile 400 mikron derinliğe kadar taranır mavi calcofluor floresan olmayan harici descanned dedektörleri (NDD) (400-470 nm emisyon). 2-D görüntü ve zaman atlamalı filmleri (1 resim her 5-10 saniye) yanı sıra, tek veya tekrarlayan 3-boyutlu resim yığınlarını sonradan voksel kaplamalar kullanarak ya da tek uzun odak görüntü veya 4-D (zamanla 3D) olarak işlenecek farklı yazılım paketleri. Bu mikroskobik kurulum havadaki patojenlerin çeşitli giriş bağlantı noktası oluşturur, muazzam bir immünolojik alaka, neredeyse bozulmamış bir ortamda hücresel davranış gözlem sağlar. Hücre motilite, fagositoz ve küf Aspergillus enfeksiyonu takiben endojen nötrofil NET üretim yerinde koşullarda kolayca bu altında incelenebilir.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Eğer yapılırsa düzgün görüntüleme 2 üretecektir - veya 3-renkli dia veya film. Boyama sonrası bir işleme prosedürü yapılır ve böylece özgürce adapte olmasına rağmen, genelde göreceli kanal tespit boya / sinyal, doğal renk yansıtan bir boyama düzenini seçin. Böylece, Sytox boyalar varsa, EGFP-işaretli hücrelerin yeşil lekeli, kırmızı, mantar gibi SHG sinyal mavi ile gösterilmiştir tasvir ve. İlk örnekte (Şekil 1) mavi SHG sinyali ile enfekte olmayan akciğer dokusu lifleri ve kırmızı Sytox sinyal, akciğer yerleşik hücrelerinin çekirdekleri tarafından üretilen vibratome tarafından kesilerek açılır gösteriyor. Hem de alveoler yapıların yanı sıra mantar kitlelerin, mavi renkte görünmesi, çekirdek ve NET'ler kırmızı lekeli ikinci örnekte (Şekil 2) virüslü bir akciğer, gösterilir. Üçüncü örnek (Şekil 3), yeşil, mavi ve kırmızı yapıların yanı sıra nötrofiller de görülebilir Lys-EGFP transgenik hayvan. Nötrofil ve zaman atlamalı dizileri bireysel mantar elemanlarının fagositoz göç tamamlayıcı film gösterilmiştir.

Şekil 1. Enfekte olmayan akciğer dilim 2-renkli bir görünüm 2-foton mikroskopi. Akciğer dilim olmayan enfekte fare C57/BL6 hazırlanan ve protokol açıklandığı gibi görüntülü. Alveoler doku yapısı (A) SHG sinyal burada Sunan akciğer dilim (B) ve iki kanal (C) bir yerleşim hazırlanması sırasında, hücre çekirdeğinin Sytox sinyal açık kesti. (C) (D) kutulu alanı genişlemiş görülür. Akciğerin alt kısmında fibröz doku olarak yukarıdaki akciğer solunum aktif alanlar içinde açıkça alveoler organizasyona kıyasla dilim dikkat ediniz.

Şekil 2. Aspergillus enfekte vahşi tip hayvan akciğer dilim 2-foton mikroskopi 2-renk görünümü. 7 saat enfekte C57/BL6 fare akciğer dilim A. önce fumigatus hazırlanan ve protokol açıklandığı gibi görüntülendi. Gösterilen kombine mantar yapısı ve SHG alveolar doku (A), DNA NET'ler Sytox sinyal yanı sıra hücre çekirdekleri hazırlanması sırasında (B) akciğer dilim kesilerek açılır ve iki kanal kaplama (C) . (C) (D) kutulu alanı genişlemiş görülür. Lütfen dikkat, mantar kitleler, alveoller ve NET-yapıları açıkça farklı alanlarda sırasıyla E, A ve N harfleri ile işaretlenir.

Şekil 3. 3-renk akciğer dilim Aspergillus enfekte Lys-EGFP hayvan bir görünüm 2-foton mikroskopi Lys-EGFP fare akciğer dilim 7 saat önce enfekteA. fumigatus hazırlanan ve protokol açıklandığı gibi görüntülendi. Gösterilen kombine mantar yapısı ve SHG alveoler doku (mavi), hücre çekirdekleri ve NET'ler (kırmızı) Sytox sinyal, yanı sıra yanı sıra çok sayıda nötrofil (yeşil).

Tamamlayıcı rakam 1. Entübasyon için Fare fiksasyonu. Ketamin / Rompun anestezi altında hayvan dişlerini 22G kalıcı venöz kateter ile entübasyon kolaylaştırmak amacıyla elastik bir bant ile sabitlenir.

Tamamlayıcı rakam 2. Mekanik fare ventilasyon entübe fare 100 ul PBS içinde yeniden süspanse 1x10 ⁷ sporların bir uygulama tarafından bulaşır. Mekanik, küçük bir hayvan solunum ile enfekte fare havalandırarak mantar parçacıkları, akciğer içinde gelişmiş bir dağıtım elde edilir.

Tamamlayıcı rakam 3. Akciğer lob fiksasyon organ sağ akciğer lob ön hazırlıktan sonra, bir dizi paralel naylon konuları kapsadığı bir laboratuvar yapımı düz rondela kullanmak bir Petri kabındaki sabit .

Tamamlayıcı rakam 4. 2-foton görüntüleme kurulum sağ akciğer lob içeren Petri kabı, boya Sytox Orange DNA eklenmesinden sonra 2-foton mikroskop altında bir ısıtma matı yüklü .

Ek film: yaşayan bir mantar enfeksiyonu sonrası akciğer dilim 7 saat 2-foton mikroskopi zaman atlamalı görüldüğü gibi göç ve Aspergillus enfekte akciğerlerde mantar elemanları phagocytosing Nötrofiller Nötrofiller yeşil, mantar elemanları ve SHG mavi ve hücre çekirdekleri gibi NET yapıları kırmızı olarak tasvir edilmektedir. Deney gerçek zamanlı sağ alt köşesinde gösterilir. Ölçek çubuğu 50 mm gösteriyor. videosunu izlemek için tıklayın

Tartışma

In vivo ya da sağlam organlarda Gerçek-zamanlı 2-foton mikroskopi, son 10 yılda, bağışıklık hücrelerinin fizyolojisi ile ilgili çalışmalarda derin önem kazanmıştır. T-hücre aktivasyonu, lenf düğümleri içinde dinamikleri gibi önemli olaylar ilk ^2-4 görünür hale geldiği, bu tekniği ile oldu . Daha yakın zamanlarda, araştırmacılar da, bu ^{yaklaşımın} 5 kullanarak lenfatik dokular efektör hücrelerinin üretimi ilk adımları gibi spesifik hücresel fonksiyonları analiz etmeye başladık .

Ancak, bu yöntemi kullanarak bir dizi yeni biyolojik kavramların ortaya olmasına rağmen, hala zorlu ve hiçbir intravital görselleştirme çalışmaları şimdiye kadar yayınlanmış olan hangi önemli sorular vardır. Özellikle bu memeli akciğer için de geçerlidir. Bu organ ilginç yönü, havadaki patojenlerin çeşitli giriş bağlantı noktası olarak, immünolojik süreçleri memeli vücutta yer aldığı en önemli yüzeylerin biri yapar. Bütün ömrü boyunca her nefeste, istenmeyen parçacıklar olan ve hayatı tehdit eden enfeksiyonlara ⁶ neden potansiyeline sahip bazı solunması. Savunma mekanizmalarının böyle bir hassas ve nesilleri tükenme tehdidi altında olan bir yerinde sıkı bir ağ bağışıklık yanıtlarını tüm repertuar sergileyen bulunması gereken bu kendi kendini açıklayıcı. Öte yandan, böyle bir "kirli" bir yerde potansiyel patojenlere karşı uyarılan immünolojik mücadele sıkı kontrol olması çok önemlidir. Bağışıklık sisteminin abartılı tepkiler, kitlesel belirsiz immün hücre ^eylemleri 7,8 uyarılması üzerine organ doku yaralanmasına kendi bedeni zarar yüksek bir risk taşımaktadır .

Bu düşünceler ışığında, in vivo koşullarda gerçek altında memeli akciğerlerde hücre davranışı araştırmak için son derece ilginç ve yararlı olacaktır. Ancak, böyle bir sistemin şimdiye kadar başarılı bir çalışma protokolü kurma çözülmesi gereken çok büyük zorluklar açıkça noktaları uygulamaya henüz sahip olduğu bir gerçektir. En zorlu meydan muhtemelen odak istikrar. Nefes sorumlu organı olarak akciğer inhalasyon gerçekleştirmek için alan her üç yönde sürekli hareket altındadır. Bu durum tek başına, ciddi görüntüleme sorunlara neden olur ve bir intravital görüntüleyiciler "kabus" olarak kabul edilebilir. Zaten uzayda herhangi bir boyut için hafif bir hareket, mikroskobik görüntüsü, anlamlı görüntüler ^oluşturmak için 9 mikrometre hassasiyetle kararlı olması gereken büyük bir bozulan bir etkiye sahiptir. Doğal sıkı yerel odak göz ^{önüne alındığında,} 10, 2-foton mikroskopi, odak kararsızlıkları bile daha duyarlı Z-yönünde sadece birkaç mikrometre aralığında belirli bir yapının bir çıkığı olarak tam bir odak kaybına eşdeğerdir ve dolayısıyla başarısız bir deneme.

Fare akciğer içinde bağışıklık hücreleri, gözlem için bu çalışmada sunulan protokol, işlevsel sağlam ^akciğer 11 durum in vivo uygulama değil, yakın bir değildir. Eksplante lenf örneğin görüntüleme lenfositler için ex vivo yaklaşımları , düğümleri, in vivo gözlemler ¹² gerçek eşdeğer sonuçlar gösterilmiştir ve bu nedenle ⁵ derece alakalı. Yaklaşımı ile mümkün olan akciğer dilimleri, yerinde gözlemler, virüslü bir akciğer, kısa bir süre eksizyon sonra gerçekleşecek . Kesme işlemi sırasında 3D bütünlüğünü agaroz matris, akciğer tam kontrollü kesme işlemi sağlamak için önemli bir adım tarafından sağlanmaktadır. Agaroz matris bir katılaşma izin vermek için kısa bir süre için eksplante akciğer soğutmak için gerekli olmasına rağmen, kesme ve doku rewarming sonra hücreleri için yakın fizyolojik koşullara dönmek mümkün. Bu açıkça, bu koşullar altında nötrofillerin son derece aktif ve Aspergillus enfeksiyonu etkili bir şekilde temizlenmesi için gerekli olan çevik fagositler, potansiyellerini tam olarak sergilemek olduğunu göstermek bizim veri gösterilir. Bunlar alveoller iç bölgelerine ulaşmak için epitel engelleri geçerek akciğer dokusunda devriye ve bunun da ötesinde, mantar sporlarının aktif 11 kadar sürebilir. Bu çalışmanın bir anahtar bulgu Aspergillus enfekte organ Nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NET) benzeyen yapılar görünümünü oldu. NET'ler nötrofil ¹³ yeni savunma mekanizması çok yakın bir bulgudur . Ancak, 2004 yılında ilk açıklamasını bu yana, hayvan modellerinde ya da bu fenomeni gözlenmiştir veya eksik olan insanlarda fizyolojik veya patolojik koşullar ^sayısı patlayarak 14-16 artan olmuştur. İlginçtir ki, çok çalışma, bu yapıların çok farklı gruplar tarafından harcanan olmasına rağmen, çoğu raporda hala çok açıklayıcı bir seviyede ve çok değilNET sürümü mekanizması ve düzenlenmesi ile ilgili bilinir. Protokolü ile virüslü bir akciğer NET lifler göstermek için ilk kez başardık. Ayrıca, biz, kendi oluşumu veya ^inhibisyonu 11 için taze işe nötrofil yanı sıra moleküler mantar yapıların önemini göstermek . Bu yöntemi daha ayrıntılı NET oluşumu tek adımları araştırmak için potansiyeli açık bir şekilde göstermektedir. Bir evlatlık transfer deneylerde NET oluşumu becerilerini gözlemlemek için uygun fareler knock-out nötrofil kullanmak örneğin düşünebiliriz.

Böylece periferik kan nötrofil göç doğrudan gözlem Organ eksplantasyonunun sonra kan arz eksikliği nedeniyle bu sistem ile mümkün olmamasına rağmen, biz hala bizim protokol görüntüleme sağlayan bir işlemek için değerli ve nispeten kolay bir yaklaşım olduğuna inanıyorum akciğer enfeksiyonlarına karşı bağışıklık savunma erken veya geç adımlar. Bu nedenle, canlı hayvanların solunum akciğer içinde bu fenomenin incelenmesi yönünde önemli bir adımdır.