Method Article

Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon Canlı Görüntüleme

DOI:

10.3791/2689

⸱

June 27th, 2011

 , 
1Department of Oncological Sciences, Huntsman Cancer Institute, University of Utah

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dying hücreler komşu hücrelerle birlikte daralma bariyer fonksiyonunu bozmadan epitel dokuların ekstrüde. Gelişmekte zebrafish optik netlik epitel yaşam ekstrüzyon görselleştirmek için mükemmel bir sistem sağlar. Burada hücresel çözünürlükte larva zebrafish epidermisin neden ve görüntü ekstrüzyon yöntemleri açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitel dokuların Homeostatik bakım bariyer fonksiyonunu bozmadan hasarlı hücreleri sürekli çıkarılmasını gerektirir. Çalışmalarımız, ölmekte olan hücrelerin kendi çıkışına neden olabilir herhangi bir boşluk kapanış ise epitel yaprak dışarı çıkar, aktin ve miyozin bir halka oluşturacak ve sözleşme canlı komşuları sinyalleri göndermek bulduk, bir süreç olarak adlandırılan hücre ekstrüzyon 1. Gelişmekte zebrafish optik netlik epitel yaşam ekstrüzyon görselleştirmek için mükemmel bir sistem sağlar. Burada larva zebrafish epidermiste neden ve görüntü ekstrüzyon yöntemi açıklanmaktadır. Ekstrüzyon görselleştirmek için, epidermisin yeşil floresan protein tek hücreli aşamasında ifade transgenik zebrafish embriyolar F-aktin kırmızı floresan proteini etiketli prob enjekte ve larvaları için G418 ek apopitoz indükleyen. Daha sonra apoptotik hücre ekstrüzyon sürecinde aktin dinamikleri ve epitelyal hücre davranışlarını gözlemlemek için dönen bir disk konfokal mikroskop zaman atlamalı görüntüleme kullanın. Bu yaklaşım bize canlı epitel ekstrüzyon işleminin araştırmak için izin verir ve apoptotik hücreleri ortadan kaldırmak için başarısızlık neden olduğu hastalık durumlarını incelemek için bir yol sağlayacak.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon sırasında Aktin Dinamiği Görselleştirme için temel iş akışı

Gelişmekte olan zebrafish epidermisin iki farklı katmanları, yüzey tabakası (veya periderm) ve bazal membran 2 kontak hücrelerinin bazal tabaka oluşur. Dış yüzey tabakasının hücrelerde apoptozis geçmesi ve ekstrüzyon 3 (Şekil 1) doku ortadan kalkar. Bu sürecin gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için, yeşil flüoresan protein (GFP ifade tek hücreli aşama transgenik zebrafish utrophin, bir aktin bağlayıcı protein (RFP-UtrCH) 4,5, calponin homoloji etki alanı erimiş RNA kodlama ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol canlı bir epitel doku ekstrüzyon işlemini görselleştirmek için basit ve kolay bir yöntem gösteriyor. Bu tür deney bize sabit doku analizleri önceden takdir aktin dinamiklerinin inceliklerini incelemek için izin verir ve bu nedenle, ortak immunofluorescent yöntemleri tamamlar. Biz, inflamatuar yanıtlar ya da hasar gören hücrelerin birikimine yol açacaktır beklediğimiz apoptotik hücreleri, uzaklaştırmak ve temizlemek için yetmezliği ile ilişkili ekstrüzyon süreci ve çalışma hastalık durumlarında .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan Refahı Güvencesi

Zebra balığı, Danio rerio kullanarak bu protokolde yapılan tüm işlemler, Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve Utah Üniversitesi (Hayvan Refahı Güvence # 10-07.017) Komitesi (IACUC) kullanın.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bilimsel tartışma, öneri ve görüşleriniz için Rosenblatt laboratuvar üyeleri teşekkür ederim. GFP transgenik zebrafish: Biz de nazik CK plazmid kodlama RFP-UtrCH ve David Grunwald veren Mary Halloran teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, Gretchen Kral ve Zebra balığı mükemmel bir bakım ve özen Utah Üniversitesi'nde Merkezi Zebra balığı Kaynak personeli. Bu çalışma, JR için OD002056-01 DP2 NIH-NIGMS NIH Direktörü Yeni Yenilikçisi Ödülü 1 tarafından desteklenmiştir. GTE NIH Multidisipliner Kanser Eğitim Programı Hibe 5T32 CA03247-8 tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Isim Tip Şirket Katalog Numarası Yorumlar
RNeasy Mini Kit Reaktif Qiagen 74104
mMessage mMachine SP6 Kiti Reaktif Ambion AM1340
Geçiş Tankları Araç Thoren Sucul Sistemleri
Pipetleyin Pompa Araç Bel Sanat Ürünleri F3789
5 ¾ Pasteur pipetleyin Araç VWR 14672-608
Mikroenjeksiyon Kalıp Araç Adaptif Bilim Araçları I-34
100x15mm Kültür Plakası Araç Balıkçı 08-757-12
Flamming / Kahverengi mikropipet Çektirme Araç Sutter Enstrüman Şirketi Model P97
Filament ile Borosilikat Cam kılcal Araç Sutter Enstrüman Şirketi B1400-78-10 OD 1.0mm ID 0.78mm, 10cm uzunluğunda
Elektrot kavanozda Araç Dünya Hassas Aletler E210
Fenol Kırmızı Reaktif Sigma P0290 DPBS yılında% 0.5
Basınç Kontrollü mikroenjektör ve Mikromanipülatör Araç Harvard Apparatus PLI-100
35x10mm Kültür Bulaşık Araç Cellstar 627-160
G418 (Geneticin) Reaktif Gibco 10131-035 DH 50 mg / ml 2 0
Dumont # 5 Forseps Araç Güzel Bilim Araçları 11253-20
12cm Pin sahibi Araç Güzel Bilim Araçları 26016-12
Pins Ekle Araç Güzel Bilim Araçları 26.007-02-03
Glass Bottom Kültür Bulaşık 1.5 coverglass Araç Mattek P35G-1.5-10-C
Düşük eritin Agaroz Reaktif Balıkçı BP1360-100
Tricaine Reaktif Sigma A-5040
Diseksiyon Mikroskop Mikroskop Leica MZ6
Diseksiyon Mikroskop Mikroskop Nikon SMZ645
Floresan Diseksiyon Mikroskop Mikroskop Olympus S2X12
İplik Disk Konfokal Mikroskop Mikroskop Nikon Eclipse Ti Bir Yokagawa iplik disk kafası ile donatılmış
CCD Kamera Kamera Andor DV-885-VP 1002x1004x8 mikron kare piksel

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
  2. Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell ExtrusionZebrafish EpidermisActin DynamicsSpinning Disc ConfocalTime lapse ImagingApoptotic Cell RemovalGFP RFP LabelingG418 Induced ApoptosisEpidermal Barrier FunctionLive Tissue Imaging

Related Articles