Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon Canlı Görüntüleme

Summary

Dying hücreler komşu hücrelerle birlikte daralma bariyer fonksiyonunu bozmadan epitel dokuların ekstrüde. Gelişmekte zebrafish optik netlik epitel yaşam ekstrüzyon görselleştirmek için mükemmel bir sistem sağlar. Burada hücresel çözünürlükte larva zebrafish epidermisin neden ve görüntü ekstrüzyon yöntemleri açıklanmaktadır.

Abstract

Epitel dokuların Homeostatik bakım bariyer fonksiyonunu bozmadan hasarlı hücreleri sürekli çıkarılmasını gerektirir. Çalışmalarımız, ölmekte olan hücrelerin kendi çıkışına neden olabilir herhangi bir boşluk kapanış ise epitel yaprak dışarı çıkar, aktin ve miyozin bir halka oluşturacak ve sözleşme canlı komşuları sinyalleri göndermek bulduk, bir süreç olarak adlandırılan ^hücre ekstrüzyon 1. Gelişmekte zebrafish optik netlik epitel yaşam ekstrüzyon görselleştirmek için mükemmel bir sistem sağlar. Burada larva zebrafish epidermiste neden ve görüntü ekstrüzyon yöntemi açıklanmaktadır. Ekstrüzyon görselleştirmek için, epidermisin yeşil floresan protein tek hücreli aşamasında ifade transgenik zebrafish embriyolar F-aktin kırmızı floresan proteini etiketli prob enjekte ve larvaları için G418 ek apopitoz indükleyen. Daha sonra apoptotik hücre ekstrüzyon sürecinde aktin dinamikleri ve epitelyal hücre davranışlarını gözlemlemek için dönen bir disk konfokal mikroskop zaman atlamalı görüntüleme kullanın. Bu yaklaşım bize canlı epitel ekstrüzyon işleminin araştırmak için izin verir ve apoptotik hücreleri ortadan kaldırmak için başarısızlık neden olduğu hastalık durumlarını incelemek için bir yol sağlayacak.

Protocol

Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon sırasında Aktin Dinamiği Görselleştirme için temel iş akışı

Gelişmekte olan zebrafish epidermisin iki farklı katmanları, yüzey tabakası (veya periderm) ve bazal membran ² kontak hücrelerinin bazal tabaka oluşur. Dış yüzey tabakasının hücrelerde apoptozis geçmesi ve ekstrüzyon ³ (Şekil 1) doku ortadan kalkar. Bu sürecin gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için, yeşil flüoresan protein (GFP ifade tek hücreli aşama transgenik zebrafish utrophin, bir aktin bağlayıcı protein (RFP-UtrCH) ^4,5, calponin homoloji etki alanı erimiş RNA kodlama kırmızı floresan proteini enjekte ) tabakalı epitel organizatörü sitokeratin 8 ⁶ (Şekil 2A) altında. RFP-UtrCH yayg RNA enjeksiyondan sonra hayvan ifade olmasına rağmen, biz, hem RFP ve GFP özellikle epidermis (Şekil 2B) aktin dinamikleri takip etmek ifade yüzeysel epidermal hücreleri üzerinde odaklanır . Daha sonra apoptotik hücre ekstrüzyon ve görüntü dönen bir disk konfokal mikroskop kullanılarak epidermis ve aktin filamentler neden ve 4D veri setleri elde etmek için G418 ile larva davranın.

Deney başlayarak önce

1. In vitro Lineerleştirilmiş DNA şablonu mMessage mMachine SP6 kiti (Ambion) kullanarak bir RNA uyarlamak ve RNeasy Mini kiti (Qiagen) kullanılarak kapaklı RNA arındırmak. -80 3-5μl alikotları ve mağaza ° C, enjeksiyon için hazır olana kadar steril su kullanılarak ~ 60ng/ul RNA sulandırınız olun. Not: RNA bozulmasını önlemek için tekrarlayan donma / çözülme kaçının.
2. 100 x 15mm kültür plakasına E3 embriyo orta (E3)% 2'lik agaroz 40ml dökme ve bu tepsiyi mikroenjeksiyon kalıp yerleştirerek (Adaptif Bilim Araçlar, # I-34), enjeksiyon sırasında embriyoların tutmak için bir kalıp olun. Agaroz katılaşmış sonra, agaroz olukları maruz kalıp çıkarın. 4 kullanılmak üzere ° C kadar hazır plaka saklayın.
3. Filamentler (OD 1.0mm ID 0.78, 10 cm uzunluğunda) ve aşağıdaki ayarları (485 Isı, Pull 50, Hız 60, Delay / Zaman 90, Basınç 200 Sutter P-97-Pipet Çektirme borosilikat cam kullanarak enjeksiyon için kılcal iğneler çekin .) Not: Farklı türlerde cam listelenen koşulların optimizasyonu gerekecektir.
4. 1% 42 E3 ve mağaza 1mL alikotları Düşük eritin (LM) agaroz ° C Makyaj Stoklarından E3 buharlaşma agaroz konsantrasyonu artırabilir dikkatli olun.
5. Düzenli 14 saat ışık ve karanlığın ⁷ 10 saat ışık / karanlık döngüsü, standart laboratuvar koşullarında yetişkin zebrafish koruyun. Gece önce denemeyi, 3 kadın ve 2 erkek bir bölücü tarafından ayrı bir tank koyarak arkadaşı balık. Ertesi sabah, tanktaki su değişimi ve ışıkları geldiğinizde bölücü çekin.

1. Kodlama floresan Takip edilen Aktin Bağlayıcı Protein RNA Enjeksiyon

1. Buz üzerinde RNA çözülme. RNA ~ 30ng/μl son bir RNA konsantrasyonu için 1:1 oranında% 0.5 fenol Kırmızı ekleyin ve tekrar dolum çekti kılcal bir iğne 1μl çözüm yük.
2. Toplayın ~ 75 1-hücreli aşamasında ⁸ CK: E3 GFP embriyolar. Pipetleyin FST Dumont # 5 forseps ile çukur embriyolar 5 ile mikroenjeksiyon kalıp içine embriyolar toplanan ¾ yeniden süspanse edin ve yavaşça şark. Not: enjekte edilen RNA mozaik ifadesinde neden olabilir, çok hücreli aşamadır embriyo, enjekte önlemek için hızlı bir şekilde çalışmak için özen gösterin.
3. Standart bir laboratuvar diseksiyon stereomikroskopta altında RNA, basınç kontrollü mikroenjektör (Harvard Apparatus PLI-100 Pico-Enjektör) kullanarak embriyo sarısı içine enjekte edilir. Kırmızı bir nokta (fenol kırmızısı), enjeksiyondan sonra embriyo görünür olmalıdır. Her deneme için en az 50 embriyolar enjekte edilir. (RNA zebrafish embriyolar ⁹ içine enjeksiyon ayrıntılı bir protokol için önceki vallahi protokol). Not:
   1. ~ 2nl bir ses, tek hücreli aşamada embriyolara RNA enjeksiyon için kullanılmalıdır. RNA bolus enjekte RNA miktarını belirlemek için, mineral yağ, kalibre edilmiş bir mikrometre slaytta bir damla içine veya göz mercekleri yerleşik bir ölçek çubuğu ile mikroskop altında dağıtmak. RNA damlacık mükemmel bir küre olmalıdır. Cilt (nl) = 4/3πr ^3: denklem kullanılarak teslim miktarını hesaplayın. Cihaz üzerinde enjeksiyon basıncı ya da zaman değiştirerek teslim edilen ses seviyesini ayarlayın.
   2. Bakım RNA gelişmekte olan embriyonun yüksek konsantrasyonlarda toksik olabilir, fluorofor görselleştirme sağlayan RNA düşük miktarda enjekte alınmalıdır. Uygun ifade düzeyini belirlemek için, deney başlamadan önce bir doz eğrisi deney yapılabilir olmalıdır.
4. Herhangi bir gübresiz veya hasarlı yumurta kaldırmak ve 28,5 az kalan tüm embriyolar embriyolar Sırala ° C.
5. 24 saat sonra, GFP (epidermis) ve TTT (aktin) floresan yüksek düzeyde zebrafish embriyolar seçmek için floresan bir diseksiyon mikroskobu kullanın. 28.5 Seçilen embriyolar yerleştirin ° C apoptozis ikna etmek için ilaç tedavisi ile devam etmek için hazır olana kadar.

2. Zebra balığı Larva kullanarak G418 Hücre Ekstrüzyon indüksiyonu

Aminoglikozid antibiyotik G418 veya Geneticin, maruz kalma, bilinmeyen bir mekanizma ile gelişmekte olan Zebra balığı ^larvaları 3 apoptoz ve epidermal hücrelerin ekstrüzyon neden olduğunu buldular . Önemlisi, bu tedavinin sadece 4 gün sonra döllenme ve büyük larvaları üzerinde çalışır. Biz ~ 5-25 hücre, herhangi bir zamanda G418 tedavi larva Zebra balığı yüzgeci epitel ekstrüzyon bulundu olabilir bulabilirsiniz. Apoptotik ekstrüzyon hücrelerinin balık balık miktarı değişebilir, görüntüleme için birden fazla balık montaj önerilir.

1. Toplayın ve 4 gün sonrası fertilizasyon (dpf) Zebra balığı larvaları E3 3 mililitre (mL) içeren bir 35 x 10mm kültür çanak içine GFP ve RFP floresan sergileyen bir yer. Bir larvaları bu boyutu kültürü çanak 25 davranabilirsiniz.
2. Dikkatle 28.5 ° C'de 4 saat süreyle ilaç G418 ve inkübe larvaların E3 içeren 1mg/ml 3mLs medya yerine G418 ışığa karşı hassastır, bu yüzden kültür çanak kapalı ya da karanlıkta tutmaya özen gösterin.
3. Medya çıkarın ve% 0.02 Tricaine içeren önceden ısıtılmış 28.5 ° C E3 medya ile değiştirin ve larvaların montaj geçin.

3. Görüntüleme Montaj Zebra balığı Larva

1. 1,5 ml Eppendorf tüp 3 larva transferi ve tüp altına balık lavabo sonra E3 en çıkarmak. Biz agaroz katılaşır önce 3 hayvan kadar düzgün bir şekilde monte edilebilir olduğunu bulduk.
2. Mattek kültür çanak alt coverglass üzerine bir kesim pipetlemeyin ucu, pipetlemeyin 120ul tüpe% 1 LM-agaroz (42 ° C), mix ve sonra hafifçe pipetlemeyin larvaları ve agaroz karışımı kullanma.
3. Mattek çanak coverglass karşı düz ve düz iğne yönlendirmek, böylece hızlı, larvaları bağlı bir ekleme pin veya tungsten bir FST pin tutucu kullanma.
   Not: Genellikle örneklerin zarar görmesini önlerken coverglass karşı düz sağlamak için ilk şark larva ve daha sonra bir L-şekilli pin düz bir iğne kullanın.
4. Agaroz katılaşmış, yavaşça E3 Tricaine% 0.02 içeren çanak doldurun. Not: Alternatif olarak, 1mg/ml G418 uzun süreli maruz kalma larvaları öldürmek rağmen G418, indükleyici ekstrüzyon devam etmek için görüntüleme çanak E3 ilave edilebilir.

4. İplik Disk Konfokal Mikroskop kullanarak Hücre Ekstrüzyon sırasında Aktin Dinamiği ve Bireysel Epitel Hücre Davranışları Canlı Görüntüleme

Biz Zebra balığı larva geliştirme epidermis apoptotik hücre ekstrüzyon tüm süreç, yaklaşık 20 ^dakika 3 sürdüğünü buldular . Burada ekstrüzyon işlemini görselleştirmek için, zebrafish epidermisin tek bir katman aracılığıyla bir dizi z uçaklar toplamak için bir zaman atlamalı görüntüleme deneyi nasıl kurulum göstermektedir. Biz tipik widefield floresan mikroskoplar önemli aktin filamentler photobleaching ve timelapse görüntüleme için izin vermez neden olduğunu buldular. Bu nedenle, bizim çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak ve photobleaching önlemek için, dönen bir disk konfokal mikroskop kullanın. Aşağıda ele alınan ilkeler benzer mikroskop set-up uygulanabilir olmasına rağmen, Nikon mikroskop ile Andor IQ yazılımı kullanarak deney nasıl ayarlanacağı açıklanmaktadır.

1. Birincisi, Argon (488nm GFP eksitasyon) ve HeNe (561nm RFP eksitasyon) lazerler, mikroskop, kamera ve epifluorescent lamba açmak.
2. Andor IQ yazılımı (sürüm 1.10.1) içinde, görüntü istediğiniz dalga boylarını içeren bir zaman serisi protokolü oluşturmak, görüntü yakalar ve sayısı kat arasında aralıklarla frekans yakalama tekrar edilmelidir.
3. Mikroskop sahnede örnek içeren Mattek çanak yavaşça yerleştirin ve larvaları odaklanmak için iletilen ışık 20x objektif kullanın.
4. Doğru konuma 40X suya daldırma hedefi (NA 0.8) taşıyın. Bu hedefe kullanarak, alt hücresel aktin dinamikleri sorununu çözerken, ekstrüzyon sırasında hücresel davranışları takip sağlar alan başına yaklaşık 20-25 hücreleri filmi. Not: Aynı montaj ve uzun bir çalışma mesafesi ile 40X bir suya daldırma hedefi olmalıdır rağmen görüntüleme stratejileri, dik mikroskoplar uygulanabilir.
5. 40x objektif üstüne bir damla su dikkatlice yerleştirin ve hızlı bir şekilde üst Mattek çanak yerleştirin. Değile: suyun buharlaşma bir sorun olup olmadığını Zeiss Immersol daldırma çözümü de kullanılabilir.
6. Faz ya da DIC aydınlatma kullanarak örnek tanımlamak ve sonra GFP pozitif epidermisin özellikle odak 488nm Epifloresans kullanın.
7. Konfokal tarama modunu açın. Lazer yoğunluğu ve buna göre kanalların her biri için pozlama süresi (488nm ve 561nm) ayarlayın. Maruz kalma sinyali optimum tespiti için lazer güç ve zaman denge ve herhangi bir photobleaching veya toksisite önlemek için özen gösterin.
8. Ekstrüzyon hücreleri tanımlamak için, GFP etiketli epidermisin görselleştirmek ve ortasında bir küçük yuvarlak hücreli çevreleyen hücrelerden oluşan bir koleksiyon oluşan klasik bir rozet desen, bir hücre grubu tanımlamak için Epifloresans kullanın. Konfokal tarama modunu kullanarak, RFP etiketli aktin ortasında küçük yuvarlak hücre, hücre ekstrüzyon bir işaretidir etrafında bir halka olarak görünür bir birikimi de olması gerekir. Bir kere hızlı bir şekilde 4D (XYZ-Time) konfokal veri setleri elde etmek için mikroskop kurmak, ekstrüzyon hücre belirledik.
9. Ekstrüzyon hücre de dahil olmak üzere epidermisin bir tek katman, görselleştirmek, ve adım boyutu seçmek için z düzlemi içinde alt ve üst noktaları ayarlayın. Time-lapse görüntüleme, görüntü yakalama ve tekrarlama sayısı aralıklarında ayarlayabilirsiniz. Örneğin, tipik olarak 1 mikron bir adım boyu, 30 dakika boyunca her 1-2 dakikada bir, 5-10μm kapsayan bir z-serisi kazanır.
10. Verileri görüntülemek için, biz genellikle z serisi 3-D projeksiyonları yapmak ve Quick Time (Apple) ile uyumlu bir film dosyası olarak ayarlanmış verileri kaydetmek. Bu şekilde, kasılma aktin halka ve zamanla ölüyor hücre etrafında oluşan epitel davranışlar görselleştirmek.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1 apoptotik hücre ekstrüzyon şematik. Aktin filamentleri kırmızı ile gösterilen, GFP pozitif epidermal hücreler yeşil.

Şekil 2. Deneysel İş Akışı. A. deney için iş akışının şematik. B. 4dpf CK: GFP zebrafish epidermis RFP-UtrCH ifade.

Şekil 3 Hala epitel hücre ekstrüzyon işlemi sırasında canlı aktin dinamiklerini yakından takip eden bir time-lapse kare (z-projeksiyonları). Oklar, 2 dakika boyunca sözleşmeler ve kapatır komşu hücreleri tarafından oluşturulan aktin halka göstermektedir.

Discussion

Burada açıklanan protokol canlı bir epitel doku ekstrüzyon işlemini görselleştirmek için basit ve kolay bir yöntem gösteriyor. Bu tür deney bize sabit doku analizleri önceden takdir aktin dinamiklerinin inceliklerini incelemek için izin verir ve bu nedenle, ortak immunofluorescent yöntemleri tamamlar. Biz, inflamatuar yanıtlar ya da hasar gören hücrelerin birikimine yol açacaktır beklediğimiz apoptotik hücreleri, uzaklaştırmak ve temizlemek için yetmezliği ile ilişkili ekstrüzyon süreci ve çalışma hastalık durumlarında ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isim	Tip	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
RNeasy Mini Kit	Reaktif	Qiagen	74104
mMessage mMachine SP6 Kiti	Reaktif	Ambion	AM1340
Geçiş Tankları	Araç	Thoren Sucul Sistemleri
Pipetleyin Pompa	Araç	Bel Sanat Ürünleri	F3789
5 ¾ Pasteur pipetleyin	Araç	VWR	14672-608
Mikroenjeksiyon Kalıp	Araç	Adaptif Bilim Araçları	I-34
100x15mm Kültür Plakası	Araç	Balıkçı	08-757-12
Flamming / Kahverengi mikropipet Çektirme	Araç	Sutter Enstrüman Şirketi	Model P97
Filament ile Borosilikat Cam kılcal	Araç	Sutter Enstrüman Şirketi	B1400-78-10	OD 1.0mm ID 0.78mm, 10cm uzunluğunda
Elektrot kavanozda	Araç	Dünya Hassas Aletler	E210
Fenol Kırmızı	Reaktif	Sigma	P0290	DPBS yılında% 0.5
Basınç Kontrollü mikroenjektör ve Mikromanipülatör	Araç	Harvard Apparatus	PLI-100
35x10mm Kültür Bulaşık	Araç	Cellstar	627-160
G418 (Geneticin)	Reaktif	Gibco	10131-035	DH 50 mg / ml 2 0
Dumont # 5 Forseps	Araç	Güzel Bilim Araçları	11253-20
12cm Pin sahibi	Araç	Güzel Bilim Araçları	26016-12
Pins Ekle	Araç	Güzel Bilim Araçları	26.007-02-03
Glass Bottom Kültür Bulaşık 1.5 coverglass	Araç	Mattek	P35G-1.5-10-C
Düşük eritin Agaroz	Reaktif	Balıkçı	BP1360-100
Tricaine	Reaktif	Sigma	A-5040
Diseksiyon Mikroskop	Mikroskop	Leica	MZ6
Diseksiyon Mikroskop	Mikroskop	Nikon	SMZ645
Floresan Diseksiyon Mikroskop	Mikroskop	Olympus	S2X12
İplik Disk Konfokal Mikroskop	Mikroskop	Nikon	Eclipse Ti	Bir Yokagawa iplik disk kafası ile donatılmış
CCD Kamera	Kamera	Andor	DV-885-VP	1002x1004x8 mikron kare piksel