İzole, Havalandırmalı ve Enstrumanlı Fare Akciğer Karakterizasyonu Pulsatif Akış ile perfüze

Özet

Aşağıdaki protokol tecrit, havalandırma ve sağ ventrikül afterload kan akımı, hava akımı, hava yolu değişiklikleri ve vasküler değişiklikler etkilerini ölçmek için sabit veya pulsatil pulmoner vasküler basınç-akım ilişkileri ölçmek için fare akciğerler instrumenting sürecini özetliyor.

Özet

Izole, havalandırmalı ve enstrümante fare akciğer hazırlık, kararlı ve pulsatil pulmoner vasküler basınç-akım ilişkileri, pulmoner arter debisi, akış hızı dalga formu, hava yolu basıncı ve sol atriyal basınç üzerinde bağımsız denetim ölçülmesine imkan verir. Pulmoner vasküler direnç, çok noktalı, sabit bir basınç-akım eğrileri alınarak hesaplanan pulmoner vasküler empedansı frekans aralığında elde edilen pulsatil basınç-akım eğrileri hesaplanır. Önemsiz vasküler uyum etkileri, özellikle akciğer dolaşımı içerir çünkü artık klinik olarak tanınan, empedans, direnci daha sağ ventrikül afterload üstün bir ölçü. Empedans Üç önemli ölçümleri - sıfır hertz empedansı Z _0, karakteristik empedansı Z _C ve dalga yansıma R _B indeksi akışı için kullanılabilir distal arteryel kesit alanı, proksimal arteryel sertlik ve havza-yukarı havza empedans içgörü uyumsuzluğu, sırasıyla. Izole elde edilen tüm sonuçlar, havalandırılmış ve perfüze akciğerler, sempatik sinir sistemi ton, birim durumu ve anestezi etkileri bağımsız. Biz bu tekniği empedans direnç ve pulmoner emboli ve kronik hipoksi etkisi ölçmek için kullanılan ve vazoaktif ajanlar ve hastalık Z _C basınç bağımlılık kullanarak eylem siteleri (örneğin, distal proksimal vs.) Arasında ayrım yapmak. Ayrıca, bu teknikler, genetiği değiştirilmiş farelerde suşlarının akciğerler ile kullanıldığında, pulmoner vasküler yapısı ve işlevi üzerindeki etkilerinin moleküler düzeyde kusurları tespit edilebilir.

Protokol

Tuchscherer ark bu protokol, daha önce pulsatil pulmoner vasküler basınç-akım ilişkileri, pulmoner emboli ve kronik hipoksi etkisi (Tuchscherer, Webster ve Chesler, 2006 ölçmek için kullanılır olmuştur izole bir, havalandırılmış perfüze fare akciğer hazırlık göstermektedir , 2007). Kısacası, fare akciğerler ameliyatla ısıtılan bir odasında yer, çevre dokulara izole (IL-1, Harvard Apparatus, Holliston, MA) ve havalandırmalı (Ventilasyon Kontrol Modülü (VCM)-R zamanlayıcı sayıcı modülü (TCM); Harvard Aparat). Akciğer vasküler kararlı akım dalga biçimleri ya da yüksek frekanslı salınım pompası (Bose-Elektro Kuvvetleri, Eden oluşturmak için bir şırınga pompası (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) ile% 3,5 Ficoll ısıtmalı RPMI 1640 hücre kültür ortamı ile perfüze Prairie, MN) pulsatil pulmoner vasküler akışı dalga şekilleri yaratmak için şırınga pompası ile paralel. Basınç dönüştürücüleri (P75, Harvard Apparatus) anlık pulmoner arter basıncı (PAP) ve sol atrial basınç (LAP) ölçer. Ani debisi (Q), bir in-line debimetre (Transonik Systems, Inc, Ithaca, NY) ile ölçülür. Pulsatil basınç-akım ilişkileri, bu ölçümleri, pulmoner vasküler fizyoloji ve patoloji ve sağ ventrikül afterload içgörü sağlamalıdır türetilmiştir.

1. Ekipman:

1. İzole akciğer fare vantilatör set-up dahil olmak üzere
2. Veri toplama sistemi ve LabView programı ile bilgisayar
3. Perfüzat akışı için iki basınç dönüştürücüleri ve debimetre
4. Basınç detektörler ve hava yolu akışı için debimetre (pnemotachometer)
5. Win Test programı ile Yüksek frekanslı salınım pompa ve bilgisayar
6. Boom / Zoom Mikroskop, lamba
7. IL-1 sistemi için yüksek çıkış pompası ısıtma banyosu

2. IL-1 sistem hazırlanması

1. Damıtılmış su - 37 ° C IL-1 sisteminin içine dolaşan ısıtma banyosunda ısıtılır.
2. Bütün pompalar, dönüştürücüler ve IL-1 kanül temiz tüp ile bağlıdır ve tüm boru, 37 kadar ısıtılır distile su ° C ile temizlendi Hava kabarcıkları akciğer ve neden ödem seyahat, kaldırılması gerekir. Salınımlı akış pompası akış sensörü ve akış sensörü pulmoner arter kanülü Boru% 1 PBS ile temizlendi.
3. P75 basınç dönüştürücüler, kanül vana kapatma, atmosfere vanaların açılması ve ardından PLUGSYS amplifikatör otomatik sıfır düğmeye basılarak zeroed. Daha sonra, atmosfere vana kapalı ve kanül vana açıldı.
4. IL-1 sistemi havalandırma yolu gözenekli seramik parçası, nem sağlamak için ıslatılmış.

3. Çözümler

1. % 3,5 hacim Ficoll-RPMI çözüm ve steril filtre ortamı hazırlayın. Medya Filtreleme istemeden akciğer embolize büyük parçacıklar vardır sağlar. Steril ortamların kullanılması da akciğer gelişen ani ödem olasılığını azaltır. Biri 10 ml şırınga RPMI her deneysel deneme için RPMI cerrahi ve bir 60 ml şırınga ile doldurun. Perfüzat 37 ° C su banyosunda ısıtın.
2. 1 ml (yaklaşık) fare heparin 500IU/100g vücut ağırlığı hazırlayın. Heparin tuz 158IU/mg. ~ 25 g fare için, küçük bir mikrosantrifüj tüp içinde 1 ml PBS solüsyonu ile 1.25 mg heparin tuzu karıştırın.

4. Havalandırma Fare

1. Fare içine kilogram başına çözüm pentobarbital 150 mg, bir pençe sert bir tutam yaparak derin anestezi sağlamak intraperitoneal sonra. Herhangi bir reaksiyon yoksa, istikrar için corkboard ön patilerini bağlantılarını ameliyatı için fare hazırlamak. Not: deney anestezi derinliği boyunca hayvan dikkatlice gözlemleyerek tarafından izlenir. Pençeleri ve sık kesiler pimleri Ağrılı uyaranlara yanıt hayvan anestezi cerrahi bir düzlemde kaldığını teyit hangi eksikliği olarak hareket ederler.
2. Kürk aşağı ıslak ve boynu cildi kapmak için düz forseps kullanımı% 95 alkol ile göğüs püskürtün. Düz makas kullanarak deride açılan bir 1 cm kesin.
3. Boyun içinde ortaya çıktığında, özefagus ve trakea arıyorsanız, tüm beyaz glandüler doku ve yüzeysel kas çıkarın. Her iki tarafında ve posteriora doku özefagus ve trakea ayırın.
4. Takın ve trakea altındaki küçük bükük forseps, diğer tarafında dikiş bir parça kapmak. Trakea altında dikiş çekin ve gevşek bir cerrahlar düğüm. Sütür sıkın ya da düğüm etmeyin.
5. Trakea küçük bir makas ile küçük açılı bir "v" Kes, trakea yoluyla tüm yol kesmeyin. Isıtmalı IL-1 sistemi mantar pano ve fare hareket ettirin. Iki künt forseps kullanarak, trakeal kanül ve "v" altında trakea yakala. Sonra, trach trakeal kanül slayt"v" açıklıktan adet. Trakea etrafında dikiş ve trakea içinde kanül güvenli trakeal kanül sıkın. Düğüm.
6. Oda havası ile ventilasyon (% 50 ilham, derin ilham ile 90 solunum / dk,) başlayın.

5. Havalandırmalı Fare perfüze

5.1. Heparin enjekte etmek için sağ ventrikül Erişim

1. Sprey fare göğüs tekrar alkol ile kürk yeniden ıslak. Düz forseps ve düz makas kullanılarak kaburga üstünde göğüs tüm cilt çıkarın. Sternum boyunca yukarı kesin. Her iki tarafta cilt kaldırın ve daha sonra alt kaburga satırı aşağıdaki cilt kesmek.
2. Cımbız ile sternum alt kısmında kılıç şeklinde sürecini kavramak ve düz makas kullanarak diyafram bir delik. Cımbız ile diyafram alın ve kaburga kesip.
3. Kılıç şeklinde bir süreç cımbız ile tekrar tutun (sol) ve kesilmiş sternum ve kaburga üzerinden topu ucu açılı makas kullanmak, akciğerler kesmeme dikkatli olma, kalp ya da kan damarları (topu ucu kullanın makas) size rehberlik etmek. Kan var olacak ama sürece sternum karşı makasla kesme kenarı olarak, kalp ve akciğerler kesilmiş olmayacaktır.
4. Sol tarafta kaburgalar tutun ve kalp açığa çıkarmak için gerekli olduğu kadar kaburga kesip. 0.1 ml heparin solüsyonu ile sağ ventrikül yavaş yavaş enjekte edin. Bu adım, endotelyal hücreler zarar ve perfüzyon bozacağına akciğerde kan pıhtılaşması, önlemek için önemlidir. Kalp hala atıyor iken heparin enjekte edilmelidir.

5.2. Ana pulmoner arter Cannulate

1. Kaburgalar hafifçe göğüs duvarından akciğerlere itmek için arka (yuvarlak) forseps sonu kullanarak (sağ ve sol tarafı) geri kalanı kesip. Akciğerler kapma kendilerini hassas doku zarar verecektir. Makas ipuçları ve akciğer dokusu arasındaki kazara temas da zarar verir.
2. Akciğer üzerine yerleştirin mikroskop taşıyın. Kalbin üstüne glandüler ve yağ dokusu kesilip. Arterler ve damarlar uzağa çekin ve sonra doku gerginlik devam ederken bahar makasla kesmek için cımbız kullanın.
3. Cımbız künt bir başka set, sol atrium / aort ve pulmoner arter (PA) altında cımbız ucu almak için ventrikül altında kalp üstten, sağdan sola kepçe kullanma. Bunu yapmak dikkatle cımbız direnç olmamalıdır. Künt cımbız kullanarak yanlışlıkla pulmoner arter veya aort delinmesiyle olasılığını azaltır.
4. Cımbız ucu aorta ve PA altına alındıktan sonra, bir parça dikiş kapmak ve çekin. Cerrahlar gevşek bir düğüm. Sütür sıkın ya da düğüm etmeyin.
5. İsteğe bağlı: vücudun alt yarısında kaldırmak için açılı makas kullanın. Kaburga ve omurga üzerinden azaltın; kesme aorta ve vena kava önemli bir miktarda kan akışına neden olacak akış sadık bir Q-tip kullanabilirsiniz. Bertarafı için bir torbaya yerleştirin.
6. 4 ml 10 ml şırınga RPMI ile Başbakan PA kanül. Çift tüm boru hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. Distile su veya kabarcıkları ile akciğer perfüzyon ödem neden olur.
7. PA eklemek kanül sağ ventrikül serbest duvarında küçük bir çentik kesin ve aşağı amaçlayan ve sağa. PA şeffaf duvarın üzerinden kanül ucu görünür olmalıdır. RPMI konumu onaylamak için küçük bir miktar demlenmeye. Kanül, aort ve PA çevresinde dikiş sıkın ve düğüm. Bu noktada sol atrium kanüle kadar gerçek perfüzyon başlamak gerektiğini, aort da bağlı olduğunu unutmayın.

5.3. Sol atrium Cannulate

1. Sol ventrikül alt kısmında bir çentik kesin ve atıl sol atriyum (LA) kanül, yukarı hedefliyor. Hafif bir basınç bu yönde mitral kapak açmak için gerekli olabilir. Doğru yerde, kanül ucu üzerine kayma ve dikiş olmadan güvenli olacaktır.

5.4. Perfüzyon başlayın

1. RMPI çıkış boru (açık PBS aksine pembe-ish renk) açıktır kadar El dakikada 0,3 ml, 10 ml şırınga RPMI demlenmeye. Çıkış boru, yeniden-pozisyon LA kanül akış varsa. Eğer yeniden konumlandırma çıkışı ile elde edilebilir, pulmoner arter bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Pulmoner arter bir sızıntı ya da gözyaşı tamir edilemez, bu deney iptal nedenidir.
2. IL-1 sistemi aracılığıyla PA kanül için 60 ml şırınga takın ve sızıntı kontrolü ve akciğerlere RPMI akciğerlere kan değiştirilmesi olduğunu gösteren, beyaza emin olun, perfüzat 1ml/min infüzyon başlatmak. Iki dakika yavaş akışı ile serpmek.

6. Ölçüm Pulsatif ve Sabit Pulmoner Basınç-Akış İlişkileri

1. Pulsatil akım çalışmaları için ilk salınım pompa piston değiştirmeler ayarlamakönceki deneylerine göre WinTest programında her frekans için istenen düzeyde. Akciğer yapısı ve mekaniği nedeniyle değişkenliği, deplasmanları her fare için ayarlanması gerekir. Sürekli akış istenilen seviyeye ayarlayın. Salınım pompa, vana açın ve sağ salınımlı akış profili (Wintest programı) çalıştırmadan önce kayıt, veri aktarımını başlatmak. Veri dosyasını açın ve Excel deneysel debi (Q) arsa. Q max ve Q min istediğiniz gibi böylece her frekansta salınım pompası piston değiştirmeler ayarlayın (Wintest programı).
2. Sürekli akış denemeleri için, salınım pompa vanasını kapatın. Bu valf açık bırakılırsa, salınım pompası başka bir akış hızı değişiklikleri nemlendirme, bir kondansatör gibi davranır. Her akış hızında veya PA basıncı kadar en az 10 saniye süreyle veri toplama% 5'ten fazla değişmez.
3. Pulsatil veya sabit akış ölçümleri için, veri toplama önce sabit bir basınç eski havalandırma. Veri toplama hemen sonra havalandırma devam edin.
4. Havayolu tüp RPMI ödem kanıt ve deneyi iptal nedenidir. Ayrıca, dönüştürücüler zarar verir, çünkü RPMI havayolu basıncı veya akış sensörleri ulaşmak izin vermeyin.

7. Temsilcisi Sonuçlar:

Temsilcisi Sabit Sonuçlar:

Izole akciğer set-up deneyci bağımsız olarak kontrol altında tutmak sadece pulmoner akım S yeteneği değil, aynı zamanda havayolu basıncı P _hava ve sol atriyal basınç LAP vardır. Q, P _hava ve LAP pulmoner damarlar ve pulmoner arter basıncı PAP etkisi nedeniyle avantajlıdır. Diğer bir avantajı, elde edilen sonuçlar, sempatik sinir ^{sisteminin tonu} 1, ses durumu, ^ve anestezi 2 bağımsız olmasıdır.

Sabit P _hava Q merdiven adım değişiklikler tarafından uyarılan ve sabit veya LAP değişen PAP değişiklikler Şekil 1'de gösterilmiştir. LAP kanül izole akciğer hazırlanmasında, tipik bir atık kabı içine perfüzat yönlendirir boru bağlı olduğunu unutmayın. Bu tüp yerinde LAP Poiseuille akışı nedeniyle Q doğrusal bağlıdır. Ancak, çıkış ve atık kabını yüksekliği sabit bir, sıfır olmayan bir LAP sağlamak için elle ayarlanabilir veya tüp Q bağımsız sıfır LAP izin silinebilir

Temsilci Pulsatif Sonuçlar:

Keyfi pulsatil akışı dalga şekilleri bu sistem ile oluşturulabilir iken, biz genellikle formu akışını oluşturmak Q = 3 + 2 sin (2 f πt) f = 1, 2, 5, 10, 15 ve 20 Hz frekanslarda ml / dak pulmoner damar (Şekil 2: üst panelde) lineerleştirilmiş empedans değerlendirmek için. PAP, LAP ve Q ölçümleri sonucunda, pulmoner vasküler empedansı büyüklüğü (Z) ve faz (θ), ilk bir dizi dayatılan her sinüzoidal akım hızı frekans ΔP = PAP-LAP ve Q bir tam sinüzoidal döngüsü çürüyen tarafından hesaplanır. Fourier dönüşümü kullanarak sinüsoidal harmonikler. Basınç oranı dönüşümü verimi büyüklüğü Z ve faz θ pulmoner vascualar empedansı, PVZ = FFT (ΔP) / FFT (Q), akış dönüşümü. Giriş empedansı Z _0, karakteristik empedansı Z _C, ve dalga yansıma R _W indeksi, empedans büyüklüğü hesaplanır. Özellikle, Z ₀ 0. harmonik (f = 0 Hz frekansları üzerinden _C, Z, Z ilk minimum (5 Hz) ve 20 Hz arasında ortalama olarak hesaplanan ortalama ve _R W hesaplanır) Z hesaplanır . (Z _{0-Z C)} / (Z ₀ + Z _C) ^3.

Şekil 1. Sabit akışı dalga şekilleri (üst satır) ve baskıların sonucunda (ikinci satır: PAP, P _hava, LAP), LAP ve _P hava farklı kombinasyonları ile zamanın bir fonksiyonu olarak . Alt sıra (A) ve (B), Q LAP artar ve azalır çıkış boru sırada yer aldı çünkü S. vs PAP gösterir. Bu tüp o LAP sürekli ve S. bağımsız (C) (D) ve (E) LAP daha yüksek ama S. _P hava bağımsız şekilde çıkış boru yüksekliği manuel olarak ayarlanabilir ya kaldırıldı inspiratuar sonu (A, C, D) veya ekspirasyon sonu (B, E) basıncı.

Şekil 2 Pulsatil akış dalga şekli Q (üst panel) ve bunun sonucunda baskılara (alt panel: PAP, LAP ve P _hava) zamanın bir fonksiyonu olarak. PVZ bu pulsatil pulmoner basınç-akım ilişkileri, toplam sağ ventrikül afterload yansıtan, hesaplanan olabilir.

Tartışma

Ameliyat kritik adımlar

Göğüs kafesi, akciğerler uzak keserken dikkatli olduğu kritik öneme sahiptir. Akciğerleri tam maruz kalan ve sınır tanımayan çevre dokulara enflasyon sırasında ancak izolasyon işlemi sırasında hasar görmediğinden olmalıdır. Forseps arka uç gibi düz bir nesne kullanımı kesmek için makas için açık bir yol var, böylece göğüs duvarı akciğerlere uzak tutmak için kullanılabilir. Diğer önemli adım, pulmoner arter ve aort etrafındaki sütür yerleştirilmesi. Köreldiğini düz bir cı...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 ml şırınga	Fisher Scientific	14-829-10F
10 ml şırınga	Fisher Scientific	14-823-2A
60 ml şırınga	Fisher Scientific	13-689-8
RPMI, GLN 6/PK ile	Fisher Scientific	MT10040CV
Şişe Üstü Filtreler	Fisher Scientific	09-761-57
Ficoll PM 70	Sigma-Aldrich	F2878-100g
Heparin	Sigma-Aldrich
Y27632	Sigma-Aldrich	Y0503
Açılı Top İris makası	Güzel Bilim Araçları	14109-09
Vannas Yaylı Makas - 4mm Bıçaklar	Güzel Bilim Araçları	15018-10
İnce İris Makası - düz	Güzel Bilim Araçları	14106-09
Dumont #5/45 Forseps	Güzel Bilim Araçları	11251-35
Dumont Tıbbi Biyoloji Forseps	Güzel Bilim Araçları	11254-20
Lauda E100 ECO-line 003	VWR uluslararası	Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922
IL-1 ile karşılaştırılabilir İzole perfüze fare akciğer sistemi	Harvard Aparatı	739904
PLUGSYS Modülü Harvard Aparatı için Kan Basıncı Dönüştürücü P75		730020
TS410 Akış Modülleri Transonik		TS410
ME 4 PXN Hassas PXN Hat İçi Akış Sensörleri	Transonic	ME 4 PXN
Cole-Parmer Çoklu Şırınga Pompaları	Cole-Parmer	EW-74900-20
Nembutal 50MG/ML 20ML Flakon	Amatheon