Biz Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak) ve embriyonik kök hücreleri (ES) kromatin protein dinamiklerini izlemek için (FLIP) Photobleaching Floresan kaybı da dahil olmak üzere photobleaching yöntemleri açıklanmaktadır. Kromatin plastisite çalışma araçlarının biri olarak kabul edilir Kromatin protein dinamiği, pluripotent hücreler geliştirilmiş.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Embriyonik Kök Hücreler Yaşayan Kromatin Protein Dynamics Tedbir Tahliller (sıkı bağlamak ve FLIP) Photobleaching
Bu makalede
Özet
Özet
Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak) ve Photobleaching olarak Floresan Kaybı (FLIP) iyi mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip canlı hücrelerin protein dinamikleri çalışma sağlar. Burada sıkı bağlamak ve kromatin proteinleri, H1 ve HP1, fare embriyonik kök (ES) hücreleri de dahil olmak üzere FLIP deneyleri gerçekleştirmek için nasıl açıklar. Sıkı bağlamak deneyde, hücreler, yeşil floresan protein (GFP) veya bunların türevleri (YFP, CFP, Kiraz, vb.) Ile kaynaşmış bir ilgi protein, ya geçici ya da stabil bir şekilde, transfekte vardır. Transfekte floresanlama hücreleri, yoğun bir ilgi odaklı lazer ışını nispeten küçük bir bölge (ROI) beyazlatıcılar. Lazer dalga boyu, füzyon için kullanılan floresan protein göre seçilir. Geri dönüşümsüz yatırım getirisini lazer ışığı floresan sinyal moleküllerin beyazlatıcılar ve hemen beyazlatma aşağıdaki ağartılmış alan floresan sinyal kurtarma ağartılmamış molekülleri ile ağartılmış moleküllerin yedek aracılık zaman atlamalı görüntüleme ile izlenir. Üretilen floresan kurtarma eğrileri protein hareketlilik hakkında bilgi sağlar. Floresan moleküller hareketsiz iseniz, herhangi bir floresan iyileşme görülecektir. Tamamlayıcı bir yaklaşım, Photobleaching içinde Floresan Kaybı (FLIP), lazer ışını aynı noktaya tekrar tekrar beyazlatıcılar ve başka floresanlama hücre sinyal yoğunluğu ölçülür. Bu nedenle FLIP deneyler yerine floresan kurtarma ölçmek ve sinyal çürümesi, hücresel bölmeleri arasında mekik protein hareketlilik gibi, protein belirlemek için yararlıdır. Geçici bağlanma kromatin ile ilişkili proteinlerin ortak bir özelliği. Her kromatin protein kararlı durum herhangi bir anda büyük bir bölümü kromatin bağlı olmasına rağmen, bağlama, geçici ve en kromatin proteinleri saniye sırasına göre bir ikamet süresi, kromatin üzerinde yüksek bir ciroya sahip. Bu özellikler, yüksek plastisite genom ifade 1 üretmek için çok önemlidir . Photobleaching deneyler kromatin proteinleri (heterokromatinin protein 1 (HP1), bağlayıcı histon H1 ve çekirdek histon dahil) dinamik değişimi yüksek olduğu, bu nedenle özellikle ES hücrelerinin kromatin plastisite, kromatin yapısal proteinleri, GFP-füzyon sürümlerini kullanan belirlemek için özellikle yararlı 2,3 farklılaşmış hücrelerin daha.
Protokol
1. ES Hücreler Kaplama
T = 0 sa
MEF kaplama
- Tabakanın canlı görüntüleme μ-Slaytlar 8-kuyu (ibidi; Münih, Almanya), jelatin veya odacıklı kapak camları (Lab-Tek, Rochester, NY) ile veya cam alt kültür yemekleri (Mattek; Ashland, MA). 5-30 dakika bekletin ve ücretsiz jelatin uzak aspirat.
- Tohum 22.000 MEFS / DMEM 250 ul toplam hacmi [% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş]. Hücreler doku kültürü inkübatör (37 ° C,% 5 CO2) büyümesine izin verin.
T = 6 saat
ES hücre kaplama
- Aspire DMEM.
- Tohum / ES hücre medya 250 ul toplam hacmi 15.000 R1 hücr....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hücre popülasyonlarının veya sabit hücreleri, sıkı bağlamak deneyler saflaştırılmış kromatin içeren en uygun teknikler, aksine, canlı hücrelerde kromatin protein dinamikleri değişiklikler izleyin. Kromatin protein dinamiği kromatin plastisite için iyi bir gösterge olarak bulundu. Ancak, bu fırınlama, GFP ilgi geninin gerektirdiğinden, floresan etiketinin yanı sıra protein fonksiyonu ile karışabilir. Bu nedenle, sıkı bağlamak geçmeden önce, füzyon proteini titizlikle kendi doğal muhatabı olarak aynı özellikleri ve işlevi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Biz kritik bir yorum ve sorun giderme günlük bazda photobleaching deneyler için, özellikle Meshorer laboratuar üyeleri, Shai Melcer, Adi Alajem, Edupuganti Raghu Ram, badi Sri Sailaja, Anna Mattout ve Alva Biran teşekkür ederim. EM, Joseph H. ve Belle R. Braun Yaşam Bilimleri Kıdemli Öğretim Üyesi ve İsrail Bilim Vakfı (ISF 943/09), İsrail Sağlık Bakanlığı (6007) Avrupa Birliği (IRG-206.872 ve 238.176) tarafından desteklenen İsrail Kanser Araştırma Vakfı, İbrani Üniversitesi ve İsrail Psikobiyoloji Enstitüsü İç uygulamalı Tıp Hibeler.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktifin Adı | Şirket | Katalog numarası | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| Jelâtin | Merck | 1,04078 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Μ-Slaytlar 8-iyi | ibidi | 80826 |
Kaynaklar
- Phair, R. D. Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins. Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).
- Meshorer, E.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
