Bu video, canlı hücre görüntüleme asimetrik sağlam duyu organı progenitör hücreleri ve epidermal hücrelerin bölünmesi için bir metodu tanımlar: Drosophila Pupa
Yöntem makalesi
Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa
Bu makalede
Özet
Özet
Yeşil Floresan Protein (GFP) keşfi bu yana, temel biyolojik mekanizmaları anlamak için bir araç olarak canlı hücre görüntüleme devrimci bir değişiklik olmamıştır. Çarpıcı bir ilerleme olan geniş araç mutantlar ve transgenik hatları evrimsel olarak korunmuş gelişimsel ve hücre biyolojik mekanizmaları incelemek için uygun bir model sunar Drosophila, özellikle belirgin olmuştur. Drosophila yetişkin periferik sinir sistemi (PNS) kontrol hücre kaderinin özellikleri kapak kafa, toraks, karın, bacak ve yetişkin sineğin kanat bireysel mechanosensory organlar olduğunu kıllar ve çalışılmıştır mekanizmalarının anlaşılması ile ilgilenen Notch bağımlı hücre kaderinin kararları mekanizmaları anlamak için bir model sistem olarak. Microchaetes (veya küçük kıllar) duyu organı habercisi (SOP), pupa toraks epitel hücreleri boyunca dağıtılır ve pupariation başlamasından sonra ilk 12 saat içinde belirtilmiştir. Şartname sonra, mitoz sırasında bir yavru hücre Numb hücre kaderini belirleyici ayırma, SOP hücreler bölünmeye başlar. Notch sinyalizasyon yolağı hücre özerk bir inhibitörü olarak Numb fonksiyonları.
Burada, bir arada kullanarak, sağlam pupa toraks içinde SOP hücre ve onun nesillerinde protein dinamikleri takip etmek bir yöntem doku-spesifik Gal4 sürücüleri ve GFP etiketli füzyon proteini 1,2. Bu teknik, sabit bir doku veya kültür üzerinden avantaja sahiptir eksplantlar bu şartname nöral prekürsör büyüme ve organ terminal farklılaşma bir organ bize tüm gelişmeleri takip sağlar çünkü. Bu nedenle doğrudan terminal farklılaşma değişiklikler hücre davranış değişiklikleri ilişkilendirmek. Ayrıca, mutant ve wild tip koşullar altında mitotik SOP etiketli proteinlerin dinamikleri değerlendirmek için bir repressible hücre işaretleyici (MARCM) sistemi ile canlı görüntüleme tekniği mozaik analizi ile birleştirebilirsiniz. Bu tekniği kullanarak, biz ve diğerleri, düzenlenmesi ve asimetrik hücre bölünmesi SOP hücreleri (örnekler referans 1-6,7, 8) Notch sinyal aktivasyon kontrol yeni bakış açıları ortaya çıkmıştır .
Protokol
Gerekli Malzemeler: Diseksiyon stereo mikroskop, çift taraflı bant, standart mikroskop slayt ve kapak, diseksiyon forseps (boyut 5 veya 5.5), fırça, dijital kamera ve görüntü ile silikon vakum gres, 5cc şırınga, whatman kağıt, konfokal ya da Epifloresans mikroskop yumuşak kıllı kazanım yazılım.
1. Pupa Diseksiyon
- 25 birkaç taze şişeleri görüntü isteyen bir stok ° C (Gal4 hattı ve UAS kontrol altında GFP etiketli füzyon proteini uygun kombinasyonu kullanarak) çapraz veya yer sinekler ayarlayın.
- SOP hücreleri genellikle pupa toraks pupariation başlamasından sonra on sekiz saat hızla artmaya başlar, bu nedenle, uygun bir sinek hisse senedi veya çapraz "beyaz" pupa seçin. Beyaz pupa pupa morfoloji var, ama bir saat içinde pupariated var olduğunu belirterek, pigmentsiz pupa bir durum var.
- Yaklaşık 18 saat bekleyin.
- Slayt üzerine çift taraflı bant bir parça yerleştirin. Pupa toplayın ve aşağı ventral yüzü, çift taraflı bant pupa halinde yapışır. Forseps operculum'un kenarına tutun (pupa durumda dorsal anterior ucu yuvarlak hatch)
- Yavaşça olgunlaşmamış sineğin baş gösteren operculum'un, asansör kaldırmak ve atın.
- Pupa halinde kenarındaki yırtılma başlamak için forseps kullanın. Yırtık yan pupa halinde Midsection kaldırın ve karşı tarafa getirmek, ya tamamen kaldırabilir veya bant takmak, toraks ve karın ön kısmı açığa. ( Not: Gelişmekte olan sinek ve pupa halinde arasında bir boşluk vardır. Ponksiyon davanın duvar gibi sinek yırtık değil dikkatli olun.)
- Arka sonuna doğru pupa halinde aynı tarafında boyunca kesim başlayın. Bir kez daha, sinek ponksiyon dikkatli olun. Sinek karşı tarafa pupa halinde çekin ve çift taraflı bant üzerine bastırın. Karın artık tamamen açık olmalıdır. Doğrudan sineğin başının altına yumuşak kıllı fırça yerleştirin. Sinek fırça ve pupa halinde ücretsiz yapışmış sonra, slayt kapalı sinek hafifçe kaldırmak için fırça kullanın.
2. Pupa Montaj
Diseksiyonu sonra, pupa sonra slayt ve kapak arasına monte:
- Davadan kaldırıldı İzole pupa sonra bir bardak slayt dorsal yüzü ortasına yerleştirilebilir.
- Whatman kağıt 18X18mm ortasında açılan bir 10X10 mm bırakarak bir kare kare olun. Suya daldırın kağıt doymuş kadar. Pupa etrafında yerleştirin.
- Silikon vakum gres yağı ile dolu bir 5 cc şırınga kullanımı, whatman çerçeve etrafında yağ düzgün bir tabaka uygulanır. Lamel yağ tabakası içinde uygun olmalıdır (Şekil 1) ve kalınlığı, sadece biraz daha pupa çapından daha büyük olması gerekir.
- 22x22 mm lamel merkezinde küçük bir damla su (1 ul) yerleştirin ve yukarıda hazırlık lamel gibi küçük su damlacığı kişileri bu durumda görüntü, notum için istediğiniz yüzey). Vakum yağ ve lamel ve pupa kütikül arasında düz bir temas yüzeyi tam bir mühür formu yavaşça sıkıştırın.
- Hazırlık sonra ya epifluorecence kullanarak, dik ya da ters microcopes görüntülü olabilir, konfokal (lazer tarama veya disk tipi iplik) ya da iki-foton konfokal. Eğer dikkatli değilseniz, yetişkin sinekler birkaç gün sonra kurtarıldı.
3. Temsilcisi Sonuçlar:
SOP özel Gal4 hattı ( Neuralized Gal4) mitotik mili (tubulin ya da Tau-GFP) veya histon proteinleri (H2B-GFP) etiket GFP etiketli proteinlerin geçti, bir bölümü düzlemde SOP hücre bölünmesi, hücre döngüsü uzunluğu, mitoz sayısı gözlemleyebilirsiniz zaman atlamalı görüntüleme kullanarak bölümler 9. Notch sinyalizasyon düzenleme (Numb-Numb-GFP, ya da Sanpodo ortağı önemli farklı endositik bölmeleri işaretlemek için Rab-GTPases gibi hücresel organelleri hedef Diğer füzyon proteinleri (erken Rab5-GFP endosomes veya geri dönüşüm için Rab11 GFP endosomes) veya protein -GFP), asimetrik hücre bölünmesi mekanizmaları ve membran proteini ticareti önemli bilgiler verebilmesidir 2,3,7,10,11.
Şekil 1: pupa diseksiyon ve montaj. A. Adım adım görüntüler pupa halinde kaldırmak ve montaj ve canlı hücre görüntüleme için sağlam pupa hazırlamak için prosedürü göstermektedir. Pupa bir cam slayt bağlı çift kaset sopa, sırt tarafında şişeden çıkarılır ve yerleştirilir. İlk sütun, operculum'un çıkarılması ve pupa davanın tarafı boyunca yırtılma. İkinci kolon, göğüs ve karın bölgesinden pupa halinde kaldırılması. Ücretsiz pupa sonra pupa halinde yumuşak kıllı fırça kaldırdı. B. Slayt ve kapak arasında pupa Montajı. Pupa cam slayt whatman kağıt nemlendirilmiş bir çerçeve ile çevrili, sırt tarafı yerleştirilir. 5cc 'lik enjektör fonksiyonları ekstrüde silikon vakum gres sürekli bir boncuk, kuruma gelen pupa korunması ve pupa toraks hafifçe aittir lamel yükselten, slayt lamel kombinasyonu mühür. Daldırma hedefleri (su veya yağ) kullanarak küçük bir damla su lamel ve göğüs kütikül arasında arayüz (1 ul), görüntü kalitesini önemli ölçüde geliştirir. Daha büyük bir resim görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2: Temsilcisi görüntüler, canlı SOP hücreler ve pupa diseksiyonu kullanarak ve montaj prosedürü alınan farklılaşmış dış duyu organları. A. Kontrolü altında aktin-GFP füzyon proteini ifade mitotik SOP hücre bir zaman serisi çıkarılan görüntüler Neuralized Gal4 ( Neur Gal4/UAS-actin-GFP), aktin kortikal birikimi bölünme karık (1 resim / her 2 dakika) dikkat edin. B. SOP kızı hücreleri Numb-Teklife Çağrı Dosyası (kırmızı) Ortağı ve Rab5-GFP ile tahrik co-ifade Neuralized Gal4, her iki yavru hücreye tek yavru hücre (pIIb) ve endosomes erken dağıtım Pon-RFP asimetrik dağılımı dikkat edin. C. Z-serisi volume rendering geç bir pupa aşamasında farklılaşmış dış duyu organları alınmıştır. Tırnak yapısı, bu tür mechnosensory kıllar ve epidermal kıllar manikür otofloresans (kırmızı) ortaya çıkar. Buna ek olarak, LGL-GFP (tahrik ifade MARCM sistemi kullanılmaktadır Neuralized Gal4) duyu organı öncü hücreler (yeşil) bir alt kümesidir. (Bu görüntüler, tüm Nikon C1 60X 1.45 NA amacı ile konfokal mikroskobu kullanılarak elde edilmiştir)
Tartışma
Bu video, tecrit ve montaj için kullanılan bir tekniktir göstermek Drosophila Pupaefor pupa notum SOP hücreleri canlı hücre görüntüleme. Pupa halinde pupa kaldırılması istikrarlı bir yandan, uygun araçları ve biraz pratik gerektirir, fakat öğrenmesi kolay. Pupa, evreleme diseksiyon göreli kolaylığı sağlamak amacıyla ve SOP geliştirme yayılması aşamasında alıcı, doğru olması önemlidir. Monte edilmiş, sonra pupa slayt ve kapak arasında geliştirmek için devam edecek ve çoğu durumda, pharate yetişkin aşamaya ulaşacak, ve sonunda eclose. Bizim tecrübelerimize göre, cep birkaç saat boyunca görüntülenebilir. Bu montaj tekniği (gözlemler bir aşamada olduğunu lütfen unutmayın, pupa toraks PNS öncül hücrelerin gözlem sınırlı değildir, ancak manikür yüzeye yakın ve mikroskop objektif herhangi bir hücre görselleştirmek için kullanılabilir pupa halinde) genellikle yaklaşık 10 14h puparium oluşumundan sonra, pupa öldürmeden kaldırmak olabilir. Pupa epitel hücreleri (yayınlanmamış veri) başarıyla görüntülenmiştir junctional proteinler, sitoskeletal proteinler ve vezikül kaçakçılığı düzenleyicileri var.
Pupa montaj tekniği mechanosensory morfolojisi kıllar ve manikür içsel otofloresans kullanarak epidermal kıllar görselleştirmek için, bize geç dönem pupa tarama konfokal mikroskop kullanılarak görüntü cuticular yapılar için bir yöntem geliştirmek için izin verdi. Bu görüntüler, taramalı elektron sinek manikür mikrograflar benzerler, ama canlı hayvanlardan elde edilebilir ve bize aynı anda cuticular morfolojisi ve GFP floresan ifade görselleştirmek için izin 6,7,12.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Biz J. Knoblich (IMP, Viyana) ve M. Gonzalez-Gaitan (Cenevre Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum Drosophila Hisse senetleri ve Shinya Inoue ve montaj teknikleri deniz embriyo bu tekniğin gelişmesi için ilham Hıristiyan Sardet. Bu protokol başlangıçta YN Oca laboratuvarında geliştirildi. FR ve DZ NIH RO1 NS059971 hibe, Pennsylvania Tütün İskan Fonu, ve Fox Chase Kanser Merkezi'nde tarafından desteklenmektedir.
Malzemeler
- Scotch çift kaset sopa
- Cam slayt
- 18mmX18mm lamel
- Forseps
- Whatman kağıt
- Dow Corning silikon vakum gres
- 5 ml şırınga
- Pipetter
- Konfokal veya Epifloresans mikroskop
Kaynaklar
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Roegiers, F., Younger-Shepherd, S., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Two types of asymmetric divisions in the Drosophila sensory organ precursor cell lineage. Nat Cell Biol. 3, 58-67 (2001).
- Bellaiche, Y., Gho, M., Kaltschmidt, J. A., Brand, A. H., Schweisguth, F. Frizzled regulates localization of cell-fate determinants and mitotic spindle rotation during asymmetric cell division. Nat Cell Biol. 3, 50-57 (2001).
- Emery, G., Knoblich, J. A. Endosome dynamics during development. Curr Opin Cell Biol. 18, 407-415 (2006).
- Roegiers, F., Younger-Shepherd, S., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Bazooka is required for localization of determinants and controlling proliferation in the sensory organ precursor cell lineage in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 14469-14474 (2001).
- Roegiers, F. Frequent unanticipated alleles of lethal giant larvae in Drosophila second chromosome stocks. Genetics. 182, 407-410 (2009).
- Tong, X. Numb independently antagonizes Sanpodo membrane targeting and Notch signaling in Drosophila sensory organ precursor cells. Mol Biol Cell. 21, 802-810 (2010).
- Jafar-Nejad, H. Sec15, a Component of the Exocyst, Promotes Notch Signaling during the Asymmetric Division of Drosophila Sensory Organ Precursors. Dev Cell. 9, 351-363 (2005).
- Karbowniczek, M. The evolutionarily conserved TSC/Rheb pathway activates Notch in tuberous sclerosis complex and Drosophila external sensory organ development. J Clin Invest. 120, 93-102 (2010).
- Coumailleau, F., Furthauer, M., Knoblich, J. A., Gonzalez-Gaitan, M. Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division. Nature. 458, 1051-1055 (2009).
- Emery, G. Asymmetric rab11 endosomes regulate delta recycling and specify cell fate in the Drosophila nervous system. Cell. 122, 763-773 (2005).
- Justice, N., Roegiers, F., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Lethal giant larvae acts together with numb in notch inhibition and cell fate specification in the Drosophila adult sensory organ precursor lineage. Curr Biol. 13, 778-783 (2003).
Yeniden basım ve izinler
