Fare spinal kolon stabilize ve tekrarlayan gerçekleştirmek için minimal invaziv bir protokol In vivo Omurilik görüntüleme iki foton mikroskopi kullanılarak açıklanmıştır. Bu yöntem, solunum kaynaklı hareketlerini en aza indirmek ve hiçbir hizalama veya diğer post-processing gerektiren ham görüntü verisi üretmek için bir spinal stabilizasyon cihazı ve anestezi rejimi birleştirir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
Farelerde genetik olarak belirli bir hücre türleri 2-3 in vivo 4-7 sayısız dokuların fizyolojik ve patolojik süreçler hakkındaki bilgimizi önemli ölçüde genişletti floresan proteinleri ifade etmek için tasarlanmış iki foton mikroskopi 1 kullanarak in vivo görüntüleme. Merkezi sinir sistemi (MSS) çalışmalarda, bir roman bolluk ve altında nöronlar, astrositler, mikroglia, hücrelerin davranışları hakkında sık sık beklenmedik bulgular üretti beyinde in vivo görüntüleme alanında geniş bir uygulama olmamıştır fizyolojik veya patolojik koşullar 8-17. Ancak, çoğunlukla teknik komplikasyonlar yaşayan fare omurilik çalışmalarda in vivo görüntüleme uygulanması sınırlıdır. Özellikle omurilik, akciğer ve kalp görüntüleme yaşayan omurilik zor bir görev yapan önemli bir hareket artifakı anatomik yakınlık üretir. Biz, omurga stabilizasyon, solunum kaynaklı hareketlerin azaltılması ve böylece iki foton mikroskopi in vivo fare omurilik görüntü kullanımının kolaylaştırılması omurilik görüntüleme doğasında kısıtlamaların üstesinden gelen yeni bir yöntem geliştirdi . Bu önemli bir azalma, solunum bağlı hareketleri sonucu, derin bir anestezi yöntemi ile özelleştirilmiş bir spinal stabilizasyon cihaz birleştirerek elde edilir. Bu video protokol, doku hasarı minimumda tutmak ve kanama uzun süre boyunca stabil fizyolojik şartlar altında muhafaza edilebilir yaşayan omurilik küçük bir alanda açığa çıkarmak için nasıl gösterir. Temsilci ham görüntüleri yüksek çözünürlükte in vivo ayrıntılı olarak mikroglia arasındaki yakın ilişki ve damarsal satın aldı. Timelapse dizisi canlı fare omurilik mikrogliyal süreçlerin dinamik davranışı gösterir. Ayrıca, aynı z kare sürekli bir tarama göstermekresmi hizalaması alım sonrası gerekmez görüntü ve / veya timelapse filmleri yığınları oluşturmak için bu yöntem elde edebilirsiniz olağanüstü istikrar var. Sonuç olarak, in vivo olarak devam eden fizyolojik veya patolojik süreçler uzunlamasına çalışmalar için izin veren bu yöntem, daha sonra timepoints omurilik aynı bölgede tekrar ve Reimage nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Protokol
1. Bina spinal stabilizasyon cihazı
- Narishige STS-Compact Omurilik Kelepçeleri ve Narishige MA-6N kafa tutma adaptörü sipariş edin.
- Özel tasarım ve spinal kolon ve kuyruk kenetli iken hayvan kafası desteklenen böylece paslanmaz çelik taban plakası iki Narishige parçaları hizada tutun. Tüm cihaz genellikle indirdi mikroskop sahnede mikroskop mercek altında uygun gerektiğini aklınızdan çıkarmayın.
2. Hayvan cerrahisi
- Pre-ısı mikroskop bir hava ısıtma cihazı ile oda ve 37 bakımını ° C
- Hayvan tartılır ve 100 mg ketamin, 15 mg ksilizin ve steril koşullar altında% 0.9 NaCl çözeltisi seyreltilir kg vücut ağırlığı başına 2.5 mg acepromazine, anestezik karışımı yapmak.
- Anestezik karışımı (KXA) intraperitoneal olarak enjekte edilerek hayvan anestezisi. Düzenli ayak pinching boyunca derin anestezi sağlamak için yapılmalıdırdeney. Saatlik ya da gerektiği gibi orijinal yarım doz ile tamamlayın.
- Cerrahi işlem yaparken termal destek sağlamak amacıyla küçük bir hayvan ısıtma yastığı kullanın.
- Korneal dehidratasyon ve zarar görmesini önlemek için yapay gözyaşı merhemi gözleri üzerine uygulayın.
- Kırparak bir cihaz ile ve daha sonra keskin bir bıçak ile kesi etrafındaki alanı tamamen saç kaldırmak için öncelikle hayvanın arka Tıraş.
- Tıraş edilen kıllar çıkarın ve alkol ped ile traş cilt yüzeyi dezenfekte edin.
- İstenen spinal seviye (torakal vertebra burada görüldüğü gibi) cilt üzerinde küçük bir (~ 1.5 cm) uzunlamasına insizyon yapın.
- Dikkatli bir şekilde geri çekilmeden derialtı bağ dokusu tarafından arka kas Açığa.
- Dikkatlice istenilen düzeyde paravertebral kaslar omurga ayırın. Her spinöz sürecinin her iki tarafın kasları ayırmak ve sonra bir müstakil kasları kazımak mümkün olan en az kesiler gerçekleştirinlaminer yüzeyinden yolu.
- Laminektomi hemen rostral ve kaudal silinecektir lamina seçin ve omurganın her iki tarafta spinal kelepçeler için giriş siteler hazırlamak. Dikkatle kelepçeler eklenecektir dört cepleri yapmak kas dokusunun yerini.
- Lamina altında kavisli ucu künt makas omurilik dokunmadan güvenli girilmesine olanak ucu düz dişli forseps ile omuriliğe kaldırın. Yavaş yavaş, sonra bir tarafta diğer tarafta kemik kesme ve laminektomi gerçekleştirin.
- Bir pamuklu bir bez kullanın ya da ufak bir kanama sınırlamak için kesiler yanında hazır kesilmiş küçük gelfoam emilebilir jelatin sünger parçaları yerleştirin. Gerekirse daha fazla kanama kontrolü için küçük bir gemi cauterizer kullanın. Doku yıkama önceden ısıtılmış steril yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) kullanın.
3. In vivo görüntüleme için omuriliğe ve hazırlık Stabilizasyonu
- Plac e spinal stabilizasyon cihazın taban plakası üzerinde bir yükseklik pad üzerinde hayvan ve kafa kafa tutan adaptörü güvenli.
- STS-bir cihaz, laminektomi (Şekil 1) yan önceden hazırlanmış ceplerinde hayvan ön-arka eksen boyunca spinal kelepçeler yerleştirin . Iki kelepçeler ~ 45 bir açıyla yerleştirilmiş olmalıdır ° maruz spinal kord (Şekil 1) üzerinde bir suya daldırma lens düşürmek için yeterli alana izin hayvan postero-kaudal eksenine göre.
- STS-bir cihaz hayvanın vücut görüntüleme deneyleri (Şekil 1) süresi için yükseklik pad çıkarılmasından sonra havada asılı böylece kuyruk dibinde üçüncü kelepçe yerleştirin.
- ACSF spinal kord bakım ve in vivo görüntüleme için bu çözüm mikroskop objektif daldırma kolaylaştırmak için Gelseal (Amersham Biosciences Corp) maruz omurilik etrafındaki küçük bir kuyu oluşturun.
- Önceden ısıtılmış odasının içine mikroskop kapsayan spinal stabilizasyon cihaz hayvan aktarın ve alçaltılmış bir mikroskop sahnede düz mercek altında (Şekil 1) laminektomi yerleştirerek sabitleyin.
- ACSF çözüm, spinal kelepçeler veya Gelseal temas edip etmediğini emin olmak için dikkatli bir şekilde bir su-immersion lens indirin.
- Ilgi alanlarını belirlemek ve bunun üzerine odaklanmak Epifloresans kullanın. Lazer tarama modunu açın ve in vivo görüntüleme fluorophores için filtreler görüntülü doku mevcut uygun iki foton lazer dalgaboyu, dichroics ve bandpass kullanarak gerçekleştirmek.
5. Tekrarlanan görüntüleme ve ameliyat sonrası bakım
- Görüntüleme deneyler sonunda, spinal stabilizasyon cihazdan fare kaldırmak ve Gelseal laminektomi etrafındaki alanı dikkatlice silin.Alan iyi temizleyin.
- Geri Yükleme ve laminektomi üzerinde sırt kasları sütür.
- Restore cilt üzerinde laminektomi ve sütür, betadin çubukla.
- Bir besin ve hidrasyon ek olarak 1 ml Laktatlı Ringers çözüm (Baxter Healthcare), subkutan yanı sıra analjezik tedavisi (0,1 mg / kg buprenorfin) sağlayın.
- Antiseptik tedavi intraperitoneal (fare başına düşen 0.03 ml,% 2.27 enrofloxacin enjektabl antibakteriyel solüsyon) yönetin.
- Anesteziden tam iyileşme kadar bir ısıtma pedi üzerinde hayvan ve daha sonra tek tek bu ev.
- Ameliyat sonrası 2-3 gün için cerrahi ve analjezik tedavinin her 8-12 saat sonra ilk 3-5 gün için günlük antiseptik yönetim tekrarlayın. Normal davranış ve tam bir iyileşme sağlamak için günlük hayvan izleyin.
- Aynı laminektomi ile yeniden görüntüleme, sütüre cilt ve kasların yeniden ve bölüm 2 açıklanan adımları yineleyin - 4.
- Önceki teknolojik sıçramalarda yeniden bulmakPLC `e sürekli olarak kan damarsal daha önce 10 açıklandığı gibi bir harita kullanarak alanı görüntülenmiş.
6. Temsilcisi sonuçları
Bütün hayvan prosedürleri Kaliforniya, San Francisco Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından belirlenen kurallar çerçevesinde ve Federal düzenlemelere göre. Spinal stabilizasyon aygıtı ve bir fare, bir mikroskop objektif altında cihaz üzerinde konumlandırma gösteren şematik bir resmi Şekil 1'de gösterilmiştir. Hayvanın gövdesinin altındaki solunum hareketleri için yeterli oda izin verme omurilik in vivo görüntüleme istikrarlı sağlar. Onu Cx3cr1 GFP / + transgenik fareler 18 spinal kord in vivo olarak görüntülenmiş oldu gibi Şekil 2 mikroglia ve damarsal arasında yakın bir ilişki gösterir , mikroglia endojen GFP ile etiketlenmiş. Şekil 3 yakalanma gösterir örneklerspinal aksonlar floresan protein (YFP-H hat 3) ve mikroglia (Cx3cr1 GFP / + fareler) ifade farelerde aynı omurilik alanları yapıldı gibi in vivo görüntüleme.
Şekil 1: İki foton mikroskopi kullanılarak in vivo görüntüleme için fare omurganın Sabitleme (A) ısmarlama çelik taban plakası STS-Narishige kompakt omurilik kelepçeler ve MA-6N Narishige destek ve hizalamak için kullanılır . Burada görüldüğü gibi kafa adaptörü tutarak (B), spinal istikrar cihaz üzerinde bir KXA anestezi ile anestezi yetişkin transgenik farelerin doğru yerleştirilmesi . Eklemek spinal kelepçeler hemen rostrally ve kaudal laminektomi ve açık omurilik dokusu yerleşimi gösterir.
Şekil 2 anestezi farelerin omurilik yüksek yoğunluk mikroglia hücreleri ve kan damarları in vivo görüntüleme. Öngörülen ama olmayan hizalı z yığınlarının (A), kan damarları ile yakın bir CX3CR1 GFP / + fare (kırmızı, rodamin dekstran iv enjeksiyon ile etiketli) spinal kord çok yoğun GFP pozitif mikroglia (yeşil) . (B) Yüksek büyütmeli görüntü (A) tek bir mikrogliyal hücre geminin etrafında genişletilmiş süreçleri ve omurilik parankimi doğru bir kan damarı duvarına bağlı olarak etiketlenmiş. Ölçek barlar, 10μm.
Şekil 3 farklı günlerde taşındı ve anestezi farelerin omurilik reimaged aynı aksonal segment ve mikroglia in vivo görüntüleme de Tekrarlanan. (A) YFP-lab 0 ve 5 gün eLED aksonlar. (B). Çevrelerindeki aynı vasküler yapılar ve mikroglia hücreleri, 0 ve 1 gün Cx3cr1 GFP / + farelerin omurilik in vivo olarak görüntülenmiş . Ölçek barlar, 10μm.
Movie 1 Temsilcisi timelapse dizisi in vivo fare omurilik satın aldı. Bu dizi detay ince floresan yapıları ile yoğun nüfuslu bir doku içinde zamanla damar (kırmızı, rodamin dekstran iv enjeksiyon ile etiketli) mikroglia Proses dinamiği (yeşil) ve bunların etkileşimleri gösterir. Ham görüntüleri sadece arka plan gürültü, parlaklık ve kontrast için düzeltilmiş ve timelapse film görüntü hizalama olmadan, ortalama veya bireysel uçakları z seçim z projelendirme sıralı olarak elde edilen görüntü yığınları tarafından inşa edilmiştir. Kan damarları mikroglia görüntü olarak z uçaklar benzer bir aralık içerisinde. Z düzlemi derinliği: 38 mm.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "> film izlemek için buraya tıklayın.
Film 2 Timelapse dizisi, tek bir z-düzlemi düzeyinde görüntüleme yöntemi ham istikrar göstermektedir . KXA anestezi altında spinal stabilizasyon cihaz yerleştirilir CX3CR1 GFP / + fareler omurilikte aynı tek z-düzlemi Hızlı satın alma, daha hızlı bir tarama 1 kare / s hızında ardışık çerçeve arasındaki minimum görüntü deplasman gösteriyor farenin solunum hızı. Küçük kalan deplasman muhtemelen kalp atışı nedeniyle film izlemek için buraya tıklayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Istikrarlı ve tekrarlayan yoğun nüfuslu iki foton mikroskopi kullanılarak anestezi farelerin omurilik floresan hücresel yapılarının in vivo görüntüleme yöntemi, burada açıklanan sağlar. Yakalanan istikrar, ısmarlama bir spinal stabilizasyon cihaz ve solunum kaynaklı hareket artifakı azaltan bir anestezik rejiminin bir sonucudur. Spinal stabilizasyon aygıtı fare gövdesinin altında nefes alan sağlar ve piyasada mevcut spinal kelepçeler ve baş montaj parçası (Şekil 1) kullanılarak inşa edilebilir. Bu yönt...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Biz ifşa etmek başka bir şey var.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Multipl Skleroz tarafından desteklenen Toplum hibe uyarlanmış ve / veya Davalos ve ark. J Neurosci Yöntemleri yeniden basıldı KA Şekiller ve filmler için DD ve NIH / NINDS hibe NS051470 NS052189 ve NS066361 RG4595A1 / T. Mar 30 2008, Elsevier gelen izni ile 169 (1) :1-7 2008 Telif Hakkı,.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktifi Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
| Rodamin B dekstran | Invitrogen | D1841 | Seyreltilmiş 70 kDa ACSF (3% w / v) |
| Ketamin HCl | Bionichepharma | NDC No: 67457-001-10 | Enjektabl, 50mg/ml |
| Anased | Lloyd Labs | ADA No: 139-236 | Xylazine enjektabl 20mg/ml |
| Acepromazine | Vedco | ADA No: 117-531 | Enjektabl, 10mg/ml |
| Suni gözyaşları merhem | Anka kuşu ilaç | NDC No: 57319-760 25 | Yağlayıcı |
| Betadine | Balıkçı | 19-061617 | |
| McPherson-Westcott Makas | Dünya Hassas Enstrümanlar | 555500S | Eğri, künt ucu makas |
| Düz Forseps | Dünya Hassas Enstrümanlar | 555047FT | Dişli ucu forseps |
| Küçük damar dağlamak | Güzel Bilim Araçları | 18000-00 | |
| Gelfoam | Pharma, Pfizer Inc. | Mikser Mill MM400 | |
| Kompakt spinal kord kelepçeler | Narishige | STS-A | |
| Kafa tutan Adaptörü | Narishige | MA-6N | |
| Gelseal | Amersham Biosciences Corp. | 80-6421-43 | |
| Laktatlı Ringers | Baxter Healthcare | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc | NDC No: 12.496 - 6757-1 | Buprenorfin enjektabl |
| Baytril | Bayer | ADA 140-913 | Enrofloxacin, antibakteriyel enjektabl % 2.27 (20ml) |
| Isıtma pedi - Büyük | Güzel Bilim Araçları | 21060-10 |
Kaynaklar
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Davalos, D. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420, 812-816 (2002).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385, 161-165 (1997).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Wang, X. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
- Christie, R. H. Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer's disease observed by in vivo multiphoton microscopy. J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).
- Jung, S. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat. Med. 11, 572-577 (2005).
- Kim, J. V. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J Exp Med. 203, 505-511 (2006).
- Lindquist, R. L. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).
- Schwickert, T. A. vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure. Nature. 446, 83-87 (2007).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
