Bütün bu montaj In situ Hibridizasyon protokolü E8.5-E11.5 günlük fare embriyoları gen ekspresyon çalışmaları için tekrarlanabilir, yüksek kaliteli sonuçlar sağlamak kritik adımları anlatılmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
In situ hibridizasyon Tüm monte embriyolar gen ifade desenlerinin tanımlanmasına yönelik çok bilgilendirici bir yaklaşımdır. Situ hibridizasyon işlemlerinde uzun ve teknik olarak topluca nihai sonucun kalitesine katkıda birden önemli adımlar ile zorlu. Bu protokol prob etiketleme ve performansını optimize etmek için ayrıntılı birkaç önemli kalite kontrol adımları açıklar. Genel olarak, bizim protokol ayrıntılı bir açıklamasını sunar gerekli kritik adımlar tekrarlanabilir yüksek kaliteli sonuçlar elde etmek. İlk olarak, PCR tarafından üretilen DNA şablonları in vitro transkripsiyon yoluyla digoxygenin (DIG) etiketli probların RNA üretimini açıklıyoruz. Bu miktar, bütünlüğü ve DIG-etiketli problar spesifik faaliyetini belirlemek için üç kritik kalite kontrol testlerinin açıklanmaktadır. Bu adımlar bir bütün fare embriyo endojen mRNA'ların tespit etmek için yeterli hassasiyet prob üretmek için önemlidir.Ayrıca, in situ hibridizasyon için E8.5-E11.5 günlük fare embriyo fiksasyon ve depolama yöntemleri açıklanmaktadır. Daha sonra, hibridizasyon koşulları, hibridizasyon sonrası yıkamalar ve non-spesifik hibridizasyon probu kaldırmak için RNaz tedavi ayrıntılar, ardından suyla yeniden embriyoların sınırlı proteinaz K sindirimi için ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. AP-bağlı antikor etiketli sonda görselleştirmek ve endojen transkript salgılama modelini ortaya çıkarmak için kullanılır. Temsilcisi sonuçları başarılı deneyler ve tipik suboptimal deneylerden gösterilmiştir.
Protokol
1. In vitro transkripsiyon yoluyla Spastine Özgü Riboprop nesil
- In vitro transkripsiyon şablonları için PCR ürünlerinin hazırlanması.
- Bunların 5 'uçlarında faj transkripsiyon promotör sekanslar Designing PCR primerleri.
Not: promoter sekansı duyu-strand PCR primer ve 5'end için duyu sonda transkripsiyonu için kullanılacak ilave edildi ve promoter sekansı antisens PCR primer 5'end ilave anti-sense sonda sentezlenmesi için kullanılacak 1-3. Biz sadece core promoter dizileri vs core promoter artı ek 5 'sekanslar içeren şablonları içeren şablonları arasındaki transkripsiyon verimliliğinde her....
- Bunların 5 'uçlarında faj transkripsiyon promotör sekanslar Designing PCR primerleri.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokolü açıklanan yöntemler farklı kaynaklardan bir dizi uyarlanmış ve tüm montaj E8.5-E11.5 günlük fare embriyoları için optimize edilmiştir. Omurgalı embriyolarının in situ hibridizasyon tüm montaj yöntemleri ilk 1990'ların başında 2,5-12 ortaya çıktı. Bu protokol öncelikle Xenopus embriyolar 7,8 yanı sıra fare 2,11 için geliştirilen yöntemler uyarlanmıştır. Bizim protokol vurgu büyük bir prob dikkatli kalite değerlendirmesi üzerine yerleştirilir. Yüksek kalite ve yük.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu çalışma NIH hibe R21MH082360 (BGC) ve R01HD056315 (UYM) yanı sıra Georgia Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | |
|---|---|---|---|---|
| Isim | Tip | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
| Digoxigenin-11-üridin-5'-trifosfat | Reaktif | Roche | 11209256910 | |
| Ribonükleozit trifosfat Seti | Reaktif | Roche | 11277057001 | |
| Radyoaktif RNA saflaştırılması için Hızlı Spin Sütunlar | Tedarik | Roche | 11274015001 | |
| T7 RNA polimeraz | Reaktif | Roche | 10881767001 | |
| SP6 RNA polimeraz | Reaktif | Roche | 10810274001 | |
| T3 RNA polimeraz | Reaktif | Roche | 11031163001 | |
| CTP, [α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml, 250 μCi | Reaktif | Perkin Elmer | BLU008X250UC | |
| DNaz I rekombinant, RNaz-serbest | Reaktif | Roche | 4716728001 | |
| Üre, Renksiz-beyaz kristaller veya kristal toz | Reaktif | Balıkçı | BP169-500 | |
| Jel yükleme tamponu | Reaktif | Ambion | AM8547 | |
| Hybond-N +, Amersham | Tedarik | GE Healthcare | RPN82B | |
| UV Stratalinker 2400 | Ekipman | Stratagene | ||
| Dietil pyrocarbonate | Reaktif | Sigma | D5758-100ML | |
| Heparin sodyum | Reaktif | Acros | 41121-0010 | |
| su içinde hidrojen peroksit% 30 | Reaktif | Fisher bilimsel | BP2633-500 | |
| Gluteraldehid,% 8 EM notu | Reaktif | Polysciences | 0/710 | Üreticinin talimatlarına göre dikkatli kullanın |
| Reaktif Engelleme | Reaktif | Roche | 11096176001 | -20 ° C'de% 5 hisse senedi ve depoya Yap |
| Proteinaz K | Reaktif | Roche | 3115852001 | |
| Rnaz A | Reaktif | Roche | 10109142001 | Yapmak kadar -20 ° C'de 10 mg / ml stok ve mağaza |
| Rnaz T1 | Reaktif | Roche | 10109193001 | |
| Ultrapure Formamid | Reaktif | Invitrogen | 15515-026 | |
| Levamizol hidroklorür | Reaktif | ICN Biomedicals. A.Ş. | 155228 | |
| Torula maya Ribonükleik asit, Tip VI | Reaktif | Sigma | R6625 | fenol / kloroform birkaç kez ekstre edilmiş ve çökelen DEPC-dH2O içinde tekrar süspanse edilir ve -20 ° C'de saklanmıştır |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragmanları | Reaktif | Roche | 11093274910 | |
| Presipite BM Mor AP Yüzey. Çözüm Hazır kullanın. | Reaktif | Roche | 11 442 074 001 | |
| 4 mL, Açık, Kapalı Üst, Depolama Flakon Kolaylık Seti | Tedarik | Ulusal bilimsel | B7800-2 | |
| N Bake hibridizasyon fırın Sarsıntı | Ekipman | Boekel Scientific | 136400 | |
| Sure-Tek Biyopsisi | Tedarik | Fisherbrand | 15-200-402C | |
| Paraplast Artı doku gömme orta | Reaktif | Fisherbrand | 23-021-400 | |
| Peel-A-Way atılabilir plastik doku gömme kalıpları | Tedarik | Polysciences | 18646A | |
| Colorfrost Artı Mikroskop slaytlar | Tedarik | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Nükleer Hızlı Kırmızı | Reaktif | Sigma | N8002 | |
| Cytoseal 60 | Reaktif | Richard-Allan Bilimsel | 8310-16 |
Kaynaklar
- Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
