Bu çalışmada, taşınabilir bir RRT-PCR sistemi kullanarak vahşi kuşlarda kuş gribi teşhisi açıklamaktadır. Bu yöntem, bir salgın senaryosunun tipik olmayan bir laboratuar ortamında yabani kuşlar, ekrana dondurularak kurutulmuş reaktifler yararlanır. Moleküler araçlarını kullanın, hızlı tanı için doğru ve hassas alternatifler sunuyor.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yabani Kuşlar Kuş Gribi Virüsü Hızlı Teşhis: Alanında Taşınabilir RRT-PCR ve Dondurulmuş kuru Reaktifler Kullanımı
Bu makalede
Özet
Özet
Yabani kuşlar, göç flyways boyunca gözetim isteyen, yüksek derecede patojen H5N1 alt tipi Avian influenza (HPAI) yayılmasını suçlanmıştır. Örnekleme kuş gribi virüsü yabani kuşlar (AIV) genellikle uzak bölgelerde yapılan, ancak sonuçlar genellikle moleküler testler için donanımlı bir laboratuvar numune taşıma ihtiyacı nedeniyle ertelendi. Gerçek zamanlı ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RRT-PCR), moleküler tekniği AIV tanısı için en doğru ve hassas yöntemlerden birini sunmaktadır. RRT-PCR için gerekli olan, daha önce sıkı laboratuvar protokolleri alan için adapte ediliyor. Islak reaktiflerin düzeyde hassasiyet ile, soğuk zincir gerekmez dondurularak kurutulmuş (liyofilize) reaktifler Geliştirme yerinde pratik bir hedefi uzaktan test getirdi.
Burada liyofilize reaktifler istihdam RRT-PCR ünitesi (İleri Patojen Kimlik Sağlamlaştırılmış Cihaz veya RAPID, Idaho Teknolojileri, Salt Lake City, UT) (İnfluenza A Hedef 1 Taqman kullanarak yabani kuşlar AIV hızlı tanı için bir yöntem mevcut; ASAY -ASY-0109, Idaho Teknolojileri). Reaktifler tek bir tüp içinde uygun konsantrasyonlarda test etmek için tüm gerekli bileşenleri içerir: astarlar, sondalar, enzimler, tamponlar ve iç pozitif kontrol, yanlış depolama veya ıslak reaktiflerin kullanım ile ilgili hataları ortadan kaldırır. Taşınabilir ünite İnfluenza A matrisi gen ve 2-3 saat verim sonuçları hedefleyen bir ekran yapar. Genetik alt tipleme H5 ve H7 astar ile de bu hedef hemaglutinin gen belirler.
Sistemi göçmen shorebird türleri burada gösterildiği gibi, yabani kuşlar toplanan kloakal ve orofaringeal örnekler, Kuzey Kaliforniya yakalanan batı Sandpiper (Calidrus mauri). Için uygundur. Hayvan kullanımı, US Geological Survey Batı Ekolojik Araştırmalar Merkezi ve US Geological Survey Kuş Laboratuvar Bantlama izin Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokol izledi. Bu tekniğin en önemli avantajı, uzak bir yerde bir salgın içeren şansı artan, yabani kuşların tanıyı hızlandırmak için. On-site Tanı yabani popülasyonları enfekte bireylerin belirlenmesi ve eğitimi için de faydalı olacaktır. Ev sahibi biyoloji (enfeksiyon immünolojik ve fizyolojik tepki) ve mekansal ekoloji (enfekte kuşların göç performans) hakkında bilgi toplamak için fırsat yabani kuşların uzun mesafelerde AIV için vektörler olarak hareket edebilir ölçüde içgörüler sağlayacaktır.
Protokol
1. Sis ağları ile yabani kuş yakalama
- Shorebird yakalamak için, bir bataklık, kıyı şeridi veya çamur düz olarak aktif bir toplayıcı yerinde sis ağları kurmak.
- Slayt fanyalı hattı kutup çevresindeki sis net bir ucunu döngüler ve dikey kutup çamurun içine yerleştirin.
- Net dışarı Stretch, sis net diğer ucunda fanyalı döngüler ile ikinci kutup eklemek ve dikey fanyalı hatları öğretilir emin, çamurun içine kutup eklemek.
- Bir kuş yakalanır sonra, net kuş özü ve bantlama istasyonuna dönün.
2. Kloakal çubukla örnekleme
- Yakalanmasından sonra hemen kloakal bezlerden toplayın
- Lağım ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan hızlı tanı yöntemi AIV gözetim yabani kuş örnekleri zaman verimli ve doğru test kolaylaştırır. , Taşınabilir RRT-PCR daha az katı numune depolama gereksinimleri, sıvı azot nakliyatçılar veya kuru buz mevcut değilse, bir soğuk zincir bakım pratik olabilir uzaktan durumlar için uygundur. Buna ek olarak, alan biyologlar tarafından en az bilgiye sahip laboratuar tabanlı moleküler analiz yapılacak kadar basit oldu dondurularak kurutulmuş reaktifleri ile bu numune analizi bulundu. Bu teknik, maliyet-etkin zaman.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Biz, teknik destek ve finansman (S. Schwarzbach) ve yardım (K. Spragens, T. Graham) USGS Batı Ekolojik Araştırma Merkezi, M. Scullion ve R. Idaho Teknolojileri Crisp teşekkür etmek istiyoruz. Enstitüsü, Savunma ve Hava Kuvvetleri Araştırma Laboratuvarı Anabilim Dalı destek Savunma ve İç Güvenlik (www.idhs.org) - Bu araştırma, Yenilikçi Teknoloji Merkezi himayesinde yapıldı. Hayvan kullanımı, US Geological Survey Batı Ekolojik Araştırmalar Merkezi ve US Geological Survey Kuş Laboratuvar Bantlama izin Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokol izledi. Bu yayında, ticaret, ürün, veya firma isimleri, her türlü kullanımı sadece tanımlayıcı amaçlar için ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktifin Adı | Şirket | Katalog Numarası | Yorumlar (isteğe bağlı) |
| RNeasy minivan spin kolon | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit dahil |
| Toplama tüpleri (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit dahil |
| Tampon RLT | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit dahil |
| Tampon RW1 | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit dahil |
| Tampon RPE | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit dahil |
| RNaz-bedava su | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit dahil |
| 14.3 M β-mercaptoethanol çözüm | Fisher Scientific | BP176100 | |
| % 100 etanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Bilimsel Sanayi | SI-0236 | |
| Taqman İnfluenza A Hedef 1 (Hidroliz Probe) | Idaho Teknolojileri | ASAY-ASY-0109 | |
| LightCycler 20ml kılcal tüpler | Roche Uygulamalı Bilimler | 04929292001 | |
| 2 ml tüpler için rotator Mikro-santrifüj | Idaho Teknolojileri | HIZLI kiti dahil | |
| Sağlamlaştırılmış Gelişmiş Patojen Tanımlama Cihazı (RAPID) 7200 | Idaho Teknolojileri | HIZLI kiti dahil | |
| Windows XP Professional ile Pentium tabanlı dizüstü | Idaho Teknolojileri | HIZLI kiti dahil | |
| LightCycler Veri Analizi yazılımı | Idaho Teknolojileri | HIZLI kiti dahil |
Kaynaklar
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
