Kazanç ya da fonksiyon çalışmalar kaybı ya da yerine bir amaç için fare retina hücreleri içine plazmid DNA eklenmesi için bir yöntem In vivo Sundu. Bu yöntem harici bir elektrik alanı uygulama tarafından oluşturulan hücre plazma membranlar geçirgenliği geçici bir artışa yararlanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak
Bu makalede
Özet
Özet
Memeli retina gelişimi sırasında genlerin fonksiyonel karakterizasyonu önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Gen fonksiyonu tırnakları kurucu veya koşullu kaybı üretmek için hedef maliyet ve yoğun emek, zaman alıcı gibi kalır. Bu zorluklara ek olarak, retinaya bir nakavt yaklaşımı kullanılarak genler, retina dışında istenmeyen boşa giden temel rolleri olabilir dile getirdi. Ayrıca, hücre kaderinin şartname ve / veya terminal farklılaşma önemli bir rol tanımlamak için çalışırken ektopik fonksiyon deney bir kazanç bir gen ifade etme yeteneği son derece değerli olabilir.
Biz elektroporasyon yenidoğan fare retina içine DNA plazmid hızlı ve verimli bir ortaklık için bir yöntem mevcut. 1,2,3,4 membran boyunca malzeme transferi kolaylaştıran plazma zarının geçirgenliğini geçici bir artış belirli bir alan şiddeti sonuçları üzerinde kısa elektrik darbeleri, uygulama. Çığır açan çalışma elektroporasyon yüksek ücret DNA'nın çift katlı lipid 5 üzerinden geçişine izin veren hidrofilik plazma membran gözeneklerin oluşumunu uyararak memeli hücrelerine gen transferi bir yöntem olarak kullanılmaktadır olabilir göstermiştir. Sürekli teknik gelişme, retina, burada 6, 7, 8, 9, 10 olduğu yöntemi de dahil olmak üzere birden fazla fare dokularda in vivo gen transferi için bir yöntem olarak elektroporasyon canlılığı sonuçlandı.
DNA'nın yenidoğan (P0) fare ve elektrik sinyalleri retina pigmente epitel ve retina arasına yerleştirilir, böylece DNA'nın bir cımbız elektrot kullanarak çözüm uygulanan subretinal boşluğa enjekte edilir. Fare gözleri lateral yerleşimi, gerekli negatif kutup-DNA-retina-pozitif kutup hizalama cımbız elektrot kolay yönelim sağlar. Aktarılan genlerin yoğun birleşme ve ifade postnatal günde 2 (P2) tarafından tespit edilebilir. Retina hücrelerinin önemli bir yanal göç olmaması nedeniyle, electroporated ve olmayan electroporated bölgelerde üretilir. Sigara electroporated bölgelerde uygun olan yerlerde iç histolojik kontrolleri olarak hizmet verebilir.
Retina elektroporasyon gibi CAG gibi, her yerde bulunan bir organizatörü altında bir genin, ifade etmek, ya da shRNA yapıları veya Cre-recombinase kullanarak gen fonksiyonunu bozabilir kullanılabilir. Spesifik gen sahipleri ile hücre yapıları tasarlarken daha hedefli ifadesi elde edilebilir. Electroporated hücrelerinin Görselleştirme GFP ifade bicistronic yapıları kullanılarak elde ya da eş-electroporating GFP ifadesini oluşturmak. Ayrıca, çoğul yapıları Kombinatoryal gen etkileri ya da farklı genlerin işlevi eş zamanlı olarak kazanç ve kayıp çalışması için electroporated olabilir. Retina elektroporasyon uygun ifade yapıları ve silme mutantlar üreterek genomik cis-düzenleyici elemanlar analizi için kullanılabilir. Bu tür deneylerde hücre belirli bir gen ekspresyonu 11 için yeterli veya gerekli cis-düzenleyici bölgeleri tanımlamak için kullanılır . Potansiyel deneyler sadece yapı kullanılabilirlik ile sınırlıdır.
Protokol
1. Plazmid elektroporasyon için hazırlık
Elektroporasyon için gerekli olan DNA konsantrasyonu 5μg/μl. Bu genellikle istenen plazmid çalışma miktarda DNA saflaştırma ve konsantrasyon takip Maxi-hazırlık (Qiagen) veya eşdeğer yöntemi kullanılarak amplifiye gerektirir. Çalışma miktarda DNA hazırlık aşağıdaki adımları açıklar.
- Kısım DNA 100 mikrogram (Maxi-hazırlık veya eşdeğeri) ve manipülasyon kolaylığı için 100 mcL hacmi sulandırmak.
- Fenol ekleyin; fenol miktarı yaklaşık% 60 DNA / hacim oranı (mg DNA: toplam hacim) elde etmek için hesaplanmış olmalıdır yani: 100 mikrogram DNA (100 mcL) artı 67 mcL fenol (100 mikrogram:....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
In vivo elektroporasyon DNA ifade plazmid ile retina hücrelerinin dönüşümü için hızlı ve etkili bir yöntem temsil eder. Bu yöntem, deneyci ektopik yayg ifade organizatörü kontrolü altında bir ilgi gen tanıtan veya ilgi gen hedefleme shRNA yapıları kullanarak fonksiyon testleri kaybı gerçekleştirmek için fonksiyon testleri kazanç gerçekleştirmek için olanak sağlar. Ayrıca, birden fazla DNA plazmid deneyci birden fazla genin etkilerini analiz etmek veya ilgi ikinci bir gen tanıtan bir gen yıkmak için izin, aynı a.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu çalışma, NIH R01EY020560-01 ve WM Keck Tıp Araştırma Ödülü Genç Bilim İnsanı tarafından finanse edildi. Yazarlar retina hazırlıkları ve enjeksiyonlar görüntüleme sırasında Joseph Bedont yaptığı yardım için teşekkür etmek istiyorum.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog Numarası | Yorumlar |
| Tampon Fenol Doymuş | Invitrogen | 15513-039 | N / A |
| Kloroform | JT Baker | 9180-03 | N / A |
| Sodyum Asetat | JT Baker | 3470-05 | 3 M stok |
| Hızlı Yeşil FCF | Fisher Biotech | BP123-10 | % 10 hisse senedi |
| Izopropil alkol Hazırlık | Tyco Healthcare | 6918 | N / A |
| 30-guage iğne | Terumo Tıp Corp. | SG2-3013 | N / A |
| Exmire mikroenjektör | Ito Corporation'ın | MS * E05 | N / A |
| Tweezertrode (cımbız elektrot) | BTX Instrument, Genetronics Inc. | 522 | N / A |
| Electro Meydanı Porator (Elektroporatör) | BTX Instrument, Genetronics Inc. | ECM 830 | N / A |
| Ekim Bileşik | Sakura Finetek ABD | 4583 | N / A |
Kaynaklar
- Neumann, E., Rosenheck, K. Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).
- Turnbull, R. J. Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
