Biz hypersaline mikrobiyal paspaslar yüksek molekül ağırlıklı DNA ayıklamak için geliştirilmiş bir protokol sağlar. Mikrobiyal hücrelerin DNA ekstraksiyonu ve saflaştırma mat matris önce ayrılır. Bu konsantrasyonları, kalite ve DNA boyutunu artırır. Bu protokol, diğer refrakter numuneler için kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mikrobiyal Paspas Yüksek Moleküler Ağırlıklı DNA çıkarımı
Bu makalede
Özet
Özet
Metagenomic veri Başarılı ve doğru analiz ve yorumlama, yüksek kaliteli, yüksek molekül ağırlığı (HMW) topluluk DNA verimli çıkarma bağımlı. Ancak, çevre mat örnekleri, genellikle yüksek kalite, HMW DNA yüksek konsantrasyonlarda elde etmek için zorluklar teşkil. Hypersaline mikrobiyal paspaslar, yüksek miktarda ekstraselüler polimerik maddelerin (EPS) 1. ve çıkarılan DNA alt uygulamalar inhibe edebilir tuzları içerir. Doğrudan ve sert yöntemleri genellikle refrakter örneklerinden DNA ekstraksiyonu kullanılır. Bu yöntemler, paspaslar, yapışkan bir matris, EPS direkt lizis sırasında DNA 2,3 bağlar, çünkü genellikle kullanılır . Sert ekstraksiyon yöntemlerinin bir sonucu olarak, küçük boyutları 4,5,6 parçalanmış DNA olur.
DNA, bu nedenle büyük eklemek vektör klonlama için uygun olur. Bu sınırlamaları aşmak için, biz hypersaline mikrobiyal paspaslar iyi kalite ve kantite HMW DNA ayıklamak için geliştirilmiş bir yöntem rapor. Biz karıştırma ve diferansiyel santrifüj yoluyla arka plan mat matris mikrobiyal hücrelerin ayrılması içeren dolaylı bir yöntem kullandı. Ayıklanan mikrobiyal hücrelerin DNA özü ve arındırmak için mekanik ve kimyasal işlemler bir arada kullanıldı. Bizim protokol 1,6 A 260/280 oranı, HMW DNA (35-50 kb) mat örnek gram başına yaklaşık 2 mikrogram verir. Ayrıca, 16S rRNA genleri 7 amplifikasyonu protokol bulaşanların herhangi bir inhibitör etkilerini en aza indirmek veya ortadan kaldırmak mümkün olduğunu göstermektedir . Bizim sonuçlarımız Fonksiyonel metagenomic çalışmalar için mikrobiyal paspaslar HMW DNA ekstraksiyonu için uygun bir yöntem sağlar ve diğer çevre örnekleri DNA ekstraksiyonu zorlu olduğu için geçerli olabilir.
Protokol
1. Mikrobiyal Hücre Ekstraksiyon:
- Mikrobiyal paspaslar steril bir taşlama havaneli ile iyice karıştırılarak homojenize. Yaklaşık 1 dakika süreyle homojenize mat malzeme steril kap içine Waring blender bütün 30 g (ıslak ağırlık), yaklaşık 100 mL 1 M NaCl (ya da örnek kullanım için belirli bir konsantrasyon) eklemek, üç kez ve orta hızda karışımı yerleştirin. 1 dakika boyunca -20 ° C derin dondurucuda aralıklı soğutma. Bulamaç 250 ml santrifüj şişeye aktarın ve kalan boş hacim 1 M NaCl ile doldurun. Otoklava DI su NaCl çözeltisi hazırlayın ve sterilize filtre.
- Ayrıca 30 dakika oda sıcaklığında bir vortexer (Vortex-Genie R 2) (150 rpm) sa....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Karmaşık ve oldukça çeşitli mikrobiyal mat örneklerinden tüm hücrelerin uzaklaştırılmasının pratik olmadığı göz önüne alındığında, temel endişe, ekstrakte edilen hücrelerin genel mikrobiyal mat topluluğunu ne ölçüde temsil ettiğidir. Önceki bir çalışmada, mikrobiyal 16S rRNA genlerinin PCR-DGGE analizi, bu protokolde kullanılan beş hücre uzaklaştırma adımının, genel mikrobiyal mat topluluğunu temsil eden hücreleri ekstrakte ettiğini göstermiştir7. Genel mikrobiyal topluluğu temsil eden bir hücre peleti sağlama.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Çevre Genomik Programı (Hibe No EF-0.723.707) tarafından finanse edildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
| ß-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Polietilen glikol 8000 | Promega | V3011 | 1.2 M NaCl içinde% 20 |
| Potasyum asetat | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
| Quant-iT dsDNA Assay kiti | Invitrogen | Q33130 | |
| RNaz | Epicentre | MRNA092 | |
| Sodyum klorür | BDH Kimyasallar | BDH8014 | Uygun kons. |
| Sodyum dodesil Sülfat | Fisher Scientific | 03-500-509 | % 10 su |
| sodyum hexametaphosphate | Merck Kimyasallar | SX0583-3 | Su içinde% 2 |
| TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
| CHEF Mapper XA Sistemi | Bio-Rad Laboratories | 170-3670 | |
| NanoDrop 1000 spektrofotometre | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Vortexer | Bilimsel Industries Inc. | ||
| Ultraviyole Çapraz | UVP | ||
| Waring blender | Waring laboratuvar | LB10S |
Kaynaklar
- Decho, A. W. Microbial biofilms in intertidal systems: an overview. Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).
- Dupraz, C., Visscher, P. T. Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats. Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).
- Steff....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
