Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo</em

Özet

Biz lentiviral bir tek koku alma duyu nöron akson genetik manipülasyon ve görselleştirme tekniği ve terminal arborization mevcut In vivo.

Özet

Hassas bir koku alma devre Geliştirme koku ampul (OB) sinaptik hedeflere koku alma duyu nöron (OSN) aksonlar doğru projeksiyon dayanmaktadır. OSN akson büyüme ve hedefleme moleküler mekanizmaları iyi anlaşılmış değildir. Kurgulama gen ekspresyonu ve şimdiye kadar tek OSN akson ve onların terminali çardak morfolojisi görselleştirme sonraki zorlu olmuştur. Belirli bir zaman dilimi içinde tek hücre düzeyinde gen fonksiyonu çalışma için, gen ekspresyonu in vivo OSNs işlemek için lentiviral tabanlı bir teknik geliştirdi. Lentiviral parçacıklar koku epiteli (OE) mikroenjeksiyon OSNs için teslim edilir. İfade kasetleri daha sonra kalıcı transduced OSNs genom içine entegre edilmiştir. Yeşil floresan proteini ifade enfekte OSNs tanımlayan ve akson terminali çardak de dahil olmak üzere tüm morfoloji, özetliyor. Mikroenjeksiyon ve muhabir algılama arasındaki kısa gerçekleştirme süresi nedeniyle, gen fonksiyonu çalışmaları çok dar bir süre içinde geliştirme odaklı olabilir. Bu yöntem ile, en az üç gün içinde, GFP ifade tespit ettik ve enjeksiyonu takiben üç ay kadar uzun. Biz knock-down lentiviral mikroenjeksiyon aracılı aşırı ifade ve shRNA hem de elde ettik. Bu yöntem, in vivo olarak tek hücre düzeyinde OSN hücre gövdeleri ve aksonlar detaylı morfolojileri sağlar ve böylece koku alma gelişimi sırasında aday gen fonksiyonu karakterizasyonu sağlar.

Protokol

1. Hazırlık

Bu prosedür, biyogüvenlik düzeyi 2, bu nedenle aşağıdaki tüm hazırlıkları, mikroenjeksiyon işlemi gerçekleştirilen bir biyolojik tehlike kaput yapılır .

1. Hazırlayın ve ön ısıtma 37 ° C su yatağı: su dolu bir plastik saklama poşetine doldurun - boşaltılmış bir ısıtma blok inkübatör mühür ve set. Bu fareler aşağıdaki enjeksiyon kurtarmak için izin verecektir.
2. Bir biyolojik tehlikeli atık konteyneri bu yordamı tüm atık batırmak için uygun bir hacmi% 10 oranında çamaşır suyu ile doldurun.
3. % 70 etanol küçük bir açık biyolojik güvenlik kabini, steril ddH2O ve yer ile çanak ve ikinci bir yemek hazırlayın.
4. 5μL kapasiteli Hamilton şırınga, piston, tüm yol çıkardı% 70 etanol ile beden ve iğne aşağı püskürtme 33-gauge bir iğne ile sterilize edin. Tekrar tekrar çanak etanol aspirat ve en az 5 kez bu şekilde dışarı çıkarmak.
5. Şırınga kartuşu aspirasyon ve çıkarma en az 5 kez steril su ile durulayın. Kültür kaput, güvenli bir şekilde kenara şırınga yerleştirin ve kurutun.
6. ° C derin dondurucuda buz üzerinde depolama yeri ve çözülme izin -80 viral stokları çıkarın. Mikroenjeksiyon 10 ⁹ enfeksiyöz birim / ml bir titresi fare başına düşen virüs stokunun 2μL gerektirir. Lentiviruses laboratuvar kurulan protokolü (Lois ve ark, 2002) göre, ticari kaynaklardan elde edilen veya üretilen olabilir.
7. Kaputun yüzey üzerinde büyüyen bir alan sağlayan bir enjeksiyon aşamasında hazırlayın - Kimwipe bir levha ile kaplı bir 10cm kültürü çanak kullanabilirsiniz.
8. Enjeksiyon istasyonu yakınında alkol mendil düzenleyin.

2. Olfaktör epitel içine lentiviral parçacıkların Mikroenjeksiyon

Bu yöntemle yapılan tüm hayvan prosedürleri IACUC onaylanmış yönergelere göre yapılır. Mus musculus suşu C57BL/6J tüm deneylerde kullanılan hayvan modelinde gösterilmiştir.

1. Kafesin yavru bir fare (P0-P3) ve 5 dakika buz üzerinde bir kesim açık eldiven yavru koyarak hipotermi fare yavrular Anesteziyoloji.
2. Yavru sterilize Hamilton şırıngaya viral stokunun tamamen anestezi, aspirat 2μL için beklerken.
3. Enjeksiyon sahne üstünde yavru fare yerleştirin. Boynun üst kısmına doğru kulak yavaşça başın üst deri çekin. Bu nazal kavite içinde öğretilen bir cilt yüzeyini sağlamak ve enjeksiyon kolaylığı olacak.
4. Olfaktör epitel ulaşmak için cilt yüzeyinin altında 3mm hakkında burun boşluğunun üst yoluyla iğne takın. Sağ ve sol iki tarafında başına iki site (fare başına düşen toplam dört enjeksiyonları gerekli virüs = 2μL) seçerek atış başına virüs çözümü 0.5μL Microinject. Enjeksiyon siteleri birbirlerinden şaşırtmalı olmalıdır. Uygun enjeksiyon siteleri hedef için, koku ampul anahat dorsal kafatası yüzeyi arama. Bu çizgi, yarı şeffaf bir cilt ve kafatası yoluyla doğumda zar zor görünür. Her iki tarafta da iki enjeksiyon yapmak için, sadece az bir ampul anahat medial eksen rostral bir enjeksiyon hedefliyoruz. Ampul anahat lateral ikinci bir ekleme yapın, henüz ventral ampul altında bulunduğu olfaktör epitel ulaşabilirsiniz enjeksiyon mediale açısını emin olun. Koku ampul nüfuz kaçının!
5. Leke herhangi bir kalıntı virüs çözümü ya da kuru bir Kimwipe kullanarak enjeksiyon yerinde veya burun deliğine açıklıklar kaçmak kan. Hemen seyreltilmiş sıvı çamaşır suyu biohazard konteyner Kimwipes atmayın.
6. Enjekte edilen fare, su yatağı inkübatör üzerine yerleştirin.
7. Tekrar fare başına düşen virüs stokunun yaklaşık 2μL gerekecektir hatırlayarak enjekte edilecek tüm fareler için 1-4 adımları.
8. Orijinal yuvalama kafes onları dönmeden önce fareler 30 dakika boyunca su yatağı inkübatör kurtarmanızı sağlar.
9. Sıvı çamaşır suyu biyolojik tehlike bertaraf mikroenjeksiyon sahne, sterilize mendil ve herhangi bir ekstra temizlik kağıt ürünleri atın.
10. Hamilton şırınga hazırlık adımları yapılan tekrarlanan aspirasyon ve etanol ejeksiyon ve sonra su ile temizleyin. Şırınga kurumasını bekleyin.
11. Maksimum transduction verimlilik için 4 saat içinde tekrar bu prosedürü tekrarlayın. Enfekte OSNs hücre uzunluğu boyunca üç gün gibi az olarak görüntülendi olabilir.

3. Kayan koku alma ampul bölümleri, İmmünohistokimya

1. Istenilen zaman noktada enjekte fare Kurban ve perfüzyon% 4 paraformaldehid doku çözmek. OB parçalara ayır. Bir gecede gecelik ve sonra paraformaldehid PBS içinde% 30 sakaroz inkübe edin. Kuru buz OCT gömme orta göm.
2. Koronal OB bölümleri bir Kriyostat kullanarak kalınlığı 60μm elde edilir. 5ml 1x PBS (pH 7.4) ile 10cm kültürü çanak içine ampul bölümleri Sweep. Bölüm d Ekim izin PBS içinde yüzen tutulmalıdırissolve. 50ml konik bir şişenin içine yüzer bölümleri ve PBS aktarın.
3. Flakonun alt bölümlere yerleşmek için izin ver. PBS kapalı herhangi bir bölümü emme Vakum. 20ml PBS ile doku bölümleri durulayın. Yerleşmek ve vakumlama adımları tekrarlayın. 10 ml PBS ve immün için 15 mL konik flakon transfer kayan bölümleri ile yeniden süspanse edin doku. Bir kez doku kesitlerinde doku bozmadan, PBS süpernatant kapalı vakum yerleşmiştir. Ile yeniden süspanse bölümleri% 0.3 1x PBS, pH 7.4 deterjan hücre zarları delinecek izin (PBS-Tx) Triton X-100. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. PBS-Tx süpernatant ve tekrar inkübasyon iki kez kapalı Vakum.
4. Engelleme çözümünün 10 ml (PBS-Tx% 5 at serumu) doku bölümlerini iki saat oda sıcaklığında inkübe edin.
5. Her biri 15 dakika oda sıcaklığında en az iki kez PBS-Tx engelleme çözüm durulayın.
6. PBS-Tx birincil antikor çözüm 2mL hazırlayın. Reaktifler ve bu deneyde kullanılan antikorlar için donatım bölümüne bakın.
7. Primer antikor çözümü ile ikinci PBS-Tx engelleme yıkama değiştirin. 4 ° C 24-48 saat 60μm kayan bölümleri içine derinlemesine nüfuz sağlamak için yavaş yavaş sallanan bir platform (~ 30rpm) inkübe edin.
8. Inkübasyondan sonra, birincil antikor çözümü 4 dikkatli bir pipet kullanarak alınan ve saklanan olabilir ° C boyanma yoğunluğu önemli bir kaybı olmadan iki hafta içinde iki kez daha yeniden.
9. Nazik rotasyon (~ 30rpm) ile oda sıcaklığında her 20 dakika için bölümler PBS-Tx üç kez yıkayın.
10. PBS-Tx ikincil antikor seyreltme 2mL hazırlayın. Son yıkama Vakum ve doku kesitlerinde sekonder antikor çözüm ekleyin. Dış fluorofor photobleaching neden olabilir ışık, blok boyama flakon alüminyum folyo ile sarın. 4 ° C gece boyunca yavaş yavaş sallanan bir platform ve inkübe yerleştirin flakon tamamladı.
11. Uzakta vakumlama ikincil antikor çözüm atın. Bölümleri, her oda sıcaklığında 20 dakika PBS-Tx ile bir kez yıkayın. Oda sıcaklığında, her 20 dakika için PBS (pH 7.4) ile iki kez durulayın. Fluoromount G. kullanılarak cam Slaytlarınıza Mount boyanan doku kesitleri
12. Olumlu bir floresan mikroskop ile enfekte OSN ve akson Termini boyanan kesitler aracılığıyla Ekran.
13. Etiketli OSN akson ve terminal çardak üç boyutlu bir görüntü oluşturmak için, konfokal mikroskopi kullanılarak hedef OB doku dilim (z ekseni boyunca) 60μm derinliği ile optik bölümleri bir dizi yapmak.
14. Z-bölüm görüntüler Bu yığın bütünüyle terminal çardak detay da dahil olmak üzere tek bir etiketli OSN akson 360 ° dönen perspektif, daha sonra yeniden bir araya yansıtılabilir. Herhangi bir tek dönme açısı yakalanır ve 2D formatında sunumu için bir resim dosyası olarak (yani, JPG, TIFF) ihraç edilebilir.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Burada açıklanan yöntemler, in vivo lentivirüs koku alma duyu nöronları transduce. GFP ve mCherry floresan gazetecilere böylece çok görüntülenmiştir enfekte OSNs, iyi immünsitokimya üzeri myc etiketli füzyon proteini var. Bu teknik, virüslü OSNs bir bolluk sağlar. Yine de, transdüksiyon, böylece tek bir hücre morfolojisi analizi için izin sporadik tek tek etiketli OSNs sağlamak için yeterli oluşur. Ve akson terminallerindeki konfokal mikroskobu (Şekil 1) kendi doğal ortamı ortasında OB doku kesitlerinde içinde görüntülenmiş. Tüm OSN akson terminali çardak genellikle 40-50μm optik bölüm içinde büyüledi olabilir. Enfekte OSN akson terminalleri Yüksek büyütme glomerüler katman aksonal çardak morfolojisinin detaylı analiz sağlar.

Şekil 1. Tek koku alma duyu nöron, akson ve terminal çardak Yörünge A) P7 fare koku sinir tabakası (onl) gösteren bir koku ampul koronal bölümünde OMP (kırmızı) ile immunohistokimyasal ve OMP hem glomerüler katman (GL) ile boyanmış Vglut2 (gri). GFP (yeşil) ifade tek bir koku duyusal nöron akson onl içinde yolculuk yapar ve glomerüler yapı içine nüfuz eder. B) glomerul içinde akson terminali çardak morfolojisi GFP ifade tarafından açıkça vurgulanır. Vglut2 gri co-boyama, GFP pozitif bir aksonun terminal abor ayrıntılarına içinde toplam glomular alanı aydınlatır. C) lentiviral enfekte OSNs OE ifade GFP (yeşil). Olfaktör epitel cytostructure DAPI boyama (mavi) ile gösterilir. GFP ifade OE OSN hücre gövdeleri ve bunların hücresel süreçlerin görselleştirme sağlar. D) Rap1GAP2 ifadesi ile bir OSN akson ve terminal morfolojisi knock-down shRNA. Altında fare U6 organizatörü ve GFP altında Rap1GAP2 shRNA ile ikili bir ifadenin kaseti taşıyan LentivirusesCMV organizatörü OE uygulandı. Enfekte koku alma akson terminalleri GFP sadece kontrol ile kıyaslandığında daha basitleştirilmiş bir terminal çardak sergilenmektedir. Bar = 20μm.

Tartışma

OSN genomik DNA gen yapıları kalıcı transferi lentivirüs sonuçları Mikroenjeksiyon. Bu yaklaşım bize aşırı ekspresyonu veya shRNA aracılı knock-down "ile aday genler kısa vadeli veya uzun vadeli manipülasyonlar ile yarabilirsiniz. Buna ek olarak, floresan odorant reseptör popülasyonları co-lokalizasyon gözlemlemek için mevcut bir transgenik fare doğrultusunda tek OSNs etiketleyebilirsiniz. Mikroenjeksiyon OSNs lentiviral transdüksiyon için gereklidir. Biz herhangi bir başarı olmadan OSNs uyum sağlamak burun boşluğu...

Malzemeler