Yöntem makalesi

Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo

DOI:

10.3791/2951

⸱

22 Mayıs 2011

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Human Anatomy, School of Medicine, University of California, Davis

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz lentiviral bir tek koku alma duyu nöron akson genetik manipülasyon ve görselleştirme tekniği ve terminal arborization mevcut In vivo.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hassas bir koku alma devre Geliştirme koku ampul (OB) sinaptik hedeflere koku alma duyu nöron (OSN) aksonlar doğru projeksiyon dayanmaktadır. OSN akson büyüme ve hedefleme moleküler mekanizmaları iyi anlaşılmış değildir. Kurgulama gen ekspresyonu ve şimdiye kadar tek OSN akson ve onların terminali çardak morfolojisi görselleştirme sonraki zorlu olmuştur. Belirli bir zaman dilimi içinde tek hücre düzeyinde gen fonksiyonu çalışma için, gen ekspresyonu in vivo OSNs işlemek için lentiviral tabanlı bir teknik geliştirdi. Lentiviral parçacıklar koku epiteli (OE) mikroenjeksiyon OSNs için teslim edilir. İfade kasetleri daha sonra kalıcı transduced OSNs genom içine entegre edilmiştir. Yeşil floresan proteini ifade enfekte OSNs tanımlayan ve akson terminali çardak de dahil olmak üzere tüm morfoloji, özetliyor. Mikroenjeksiyon ve muhabir algılama arasındaki kısa gerçekleştirme süresi nedeniyle, gen fonksiyonu çalışmaları çok dar bir süre içinde geliştirme odaklı olabilir. Bu yöntem ile, en az üç gün içinde, GFP ifade tespit ettik ve enjeksiyonu takiben üç ay kadar uzun. Biz knock-down lentiviral mikroenjeksiyon aracılı aşırı ifade ve shRNA hem de elde ettik. Bu yöntem, in vivo olarak tek hücre düzeyinde OSN hücre gövdeleri ve aksonlar detaylı morfolojileri sağlar ve böylece koku alma gelişimi sırasında aday gen fonksiyonu karakterizasyonu sağlar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hazırlık

Bu prosedür, biyogüvenlik düzeyi 2, bu nedenle aşağıdaki tüm hazırlıkları, mikroenjeksiyon işlemi gerçekleştirilen bir biyolojik tehlike kaput yapılır .

  1. Hazırlayın ve ön ısıtma 37 ° C su yatağı: su dolu bir plastik saklama poşetine doldurun - boşaltılmış bir ısıtma blok inkübatör mühür ve set. Bu fareler aşağıdaki enjeksiyon kurtarmak için izin verecektir.
  2. Bir biyolojik tehlikeli atık konteyneri bu yordamı tüm atık batırmak için uygun bir hacmi% 10 oranında çamaşır suyu ile doldurun.
  3. % 70 etanol küçük bir açık biyolojik güvenlik kabini, steril ddH2O ve yer ile çanak ve ikinci bir yemek h....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OSN genomik DNA gen yapıları kalıcı transferi lentivirüs sonuçları Mikroenjeksiyon. Bu yaklaşım bize aşırı ekspresyonu veya shRNA aracılı knock-down "ile aday genler kısa vadeli veya uzun vadeli manipülasyonlar ile yarabilirsiniz. Buna ek olarak, floresan odorant reseptör popülasyonları co-lokalizasyon gözlemlemek için mevcut bir transgenik fare doğrultusunda tek OSNs etiketleyebilirsiniz. Mikroenjeksiyon OSNs lentiviral transdüksiyon için gereklidir. Biz herhangi bir başarı olmadan OSNs uyum sağlamak burun boşluğu.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Bu protokol, biyo-güvenlik düzeyi 2 uyumlu. Tüm uygun çalışma alanı, kişisel koruma, ve viral atık kısıtlama tedbirlerini buna göre kurulmuştur. Bütün hayvan prosedürleri IACUC kurallarına göre yapılmıştır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH DC052256 ve DC006015 ve NSF 0.324.769 QG ve T32-DC008072 BS tarafından desteklenmektedir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Mikroenjeksiyon: Yenidoğan farelere 33 iğne (Hamilton # 7762-06) ile donatılmış bir 5μL Hamilton şırınga (Hamilton # 7647-01) kullanılarak microinjected.

İmmünositokimya Reaktifler: Primer antikorlar: tavşan poliklonal antikor GFP (Molecular Probes # A-6455), OMP karşı tavuk poliklonal antikor (özel) (Chen ve ark, 2005), kobay VGlut2 karşı poliklonal antikor (Millipore # AB2251). İkincil antikorları: Cy2-konjuge eşek anti-tavşan (Jackson Immunolab # 711-225-152), eşek Cy3-konjuge anti-tavuk (Jackson Immunolab # 703-165-155) ve Cy5-konjuge keçi anti-guinea pig (Jackson Immunolab # 106-175-008). Bölüm 50ng/mL DAPI kromatin leke çözümü ile Fluoromount G (Güney Biotech # 0010-01) ile cam kızaklar üzerinde monte edilmiştir.

Konfokal Görüntüleme: Z-yığını görüntüler Olympus Flouview FV1000 konfokal mikroskop ve Olympus FV10-ASW 2.01 konfokal toplama ve analiz yazılımı kullanarak 3D projeksiyonları toplanır ve işlenmiş görüntüler kullanılarak alınmıştır.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor. J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).
  2. Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. Ad....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Lentivirus MicroinjectionOlfactory Sensory NeuronsGene Expression ManipulationGFP VisualizationConfocal MicroscopyOlfactory EpitheliumOlfactory BulbSingle Cell AnalysisIn Vivo ImagingViral Transduction

İlgili makaleler