İn Vivo Murin Karaciğer Perfüzyonu: Kemirgen Karaciğerini Portal Ven Yoluyla Çözelti ile İnfüzyon Etmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Cabral, F., et al. Fare Karaciğer Perfüzyonundan Hepatositlerin ve Sinüzoidal Endotel Hücrelerinin Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu videoda, karaciğer hücrelerini izole etmeden önce kollajenaz çözeltisi kullanılarak portal ven yoluyla fare karaciğeri perfüzyonu için bir prosedür açıklanmaktadır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Hazırlık

1. Çözeltilerin ve kültür ortamlarının hazırlanması
   1. Tüm kültür ortamını hazırlayın ve Malzeme Tablosuna göre tamponlayın.
2. Aletlerin hazırlanması
   1. 42 °C'de bir su banyosu (>10 L), değişken hızlı bir peristaltik pompa ve şişeleri tutmak için kelepçeler kurun. Kavisli makas ve forseps hazırlayın (Şekil 1).
   2. Su banyosunun üzerine veya bitişiğine, 20 x 20 cm'lik bir parça halinde kesilmiş emici bir alt ped ile kaplanmış bir strafor ped (50 mL konik raf) ile bir fırın tepsisine (yaklaşık 38 x 26 cm) yerleştirin (Şekil 1).
   3. Yakınına bir parça maskeleme bandı (5-8 cm) yerleştirin. Yakınına kesilmiş ve kullanıma hazır 20 cm'lik bir polyester dikiş ipliği yerleştirin. Geri çekilebilir bir iğne ile plastik bir kateter alın (7 mm x 19 mm, Şekil 1).
3. Züccaciye hazırlanması
   1. Kelepçeler kullanarak, 200 mL 1x PBS içeren su banyosuna 1 L'lik bir şişeyi yerleştirin ve solüsyona giren iki adet 1 mL pipeti olan bir tıpa ile hareketsiz hale getirin. Kauçuk mantar, sıvının kapalı bir devrede devridaim yapmasına izin vermek için çentiklidir.
   2. Başka bir kelepçeyle, 45 mL Tampon 2 içeren 125 mL'lik bir şişeyi, biri şişenin dibine yakın sıvıda bulunan ve diğeri sıvının üzerinde kalan ve şişeye oksijen üfleyen iki adet 1 mL pipete sahip bir tıpa ile birlikte yerleştirin.
      not: Tıpalardaki her pipet, borunun kolay değiştirilmesi için ucuna bağlı bir hızlı bağlantı kesme adaptörüne sahip olacaktır. Oksijen, sıvıya daldırılmamış tıpadaki pipet aracılığıyla her iki şişeye de nazikçe akacaktır.
   3. İki steril kristalize kabı bir kenara koyun.

2. Hayvan Prosedürü

1. PBS ve Tampon 2 çözeltilerini su banyosunda 42 °C'ye ısıtın ve sıvı hatlarını sıcak tutmak için PBS'yi kapalı bir devrede boruda en az 20 mL/dk dolaştırın. Mümkün olduğunca 42 °C'ye yakın kalmak için fazla boruyu su banyosuna daldırın. Borunun erkek ucunu PBS içeren 1 L'lik şişeye boşaltın.
2. Emici alt pedin üzerine bir pamuk topu yerleştirin ve bir transfer pipeti kullanarak pamuk topunun üzerine yaklaşık 2 mL %30 izofluran (izofluranın buharlaşma hızını azaltan polietilen glikol 200'den oluşur) ekleyin.
3. Fareyi kuyruğundan alın, kristalleşen tabaklardan birine yerleştirin ve ardından farenin anesteziyi solumak için küçük bir alana sahip olması için tabağı hızlı bir şekilde pamuk topunun üzerine çevirin. Farenin solunum hızını gözlemleyin ve farenin etkili bir şekilde anestezi altında olduğundan emin olun.
   not: Solunum hızı daha yavaş ve daha derin olmalı, kuyruk sarkık olmalı ve pençeler anestezi altında çimdikleme testine yanıt vermemelidir; daha fazla ayrıntı için IACUC yönergelerine bakın.
4. Fare anestezi altına girerken (bu 1-2 dakika sürer), pistonu dışarı çekerek ve küçük bir pamuk topu sokarak 10 mL'lik bir şırınganın namlusunu hazırlayın. Fıçının içindeki pamuğa bir transfer pipeti ile 1-2 mL %30 izofluran ekleyin ve farenin bilincini kaybetmesini beklerken namluyu açık uçlu bir masanın üzerine yerleştirin.
5. Kristalleşme kabını hızla çıkarın, fareyi sırt üstü çevirin ve şırınga namlusunu burnunun üzerine yerleştirin. Solunum hızını, ayak parmağını ve sarkık kuyruğu iki kez kontrol edin. Ayak parmağı tutamına ve sarkık kuyruğa verilen herhangi bir tepki, farenin tamamen anestezi altında olmadığını gösterir. Bilinçsizliği korumak için şırınga namlusunu burnun üzerinde tutun.
6. Başparmak raptiyelerini farenin pençeleri boyunca, uzuvlar sırtüstü pozisyonda uzanmış olacak şekilde yerleştirin. Karın ve göğüs kafesini %70 izopropanol veya etanol ile ıslatın.
7. Bir elinizdeki düz forseps ile, karın tabanına yakın cildi kaldırın. Diğer elinizde makasla çadır halindeki cildi ve karın zarını kesin. Kesi yatay veya çadırlı cildin tabanı boyunca olmalıdır. Bağırsaklara erişmek için tüm cilt ve periton katmanlarını kestiğinizden emin olun. Karın çevresini göğüs kafesine kadar her iki taraftan herhangi bir organı çentiklemeden yanal olarak kesin.
8. Alt göğüs kafesini keserek deri kanadını kesin. Portal veni ortaya çıkarmak için forsepsin arkası ile bağırsakları sağa doğru hareket ettirin.
   not: Hayvandan kanama minimum düzeyde olmalıdır; Hayvan hala nefes alıyor ve derin anestezi altında olmalıdır.
9. Kapalı kavisli forsepsleri karaciğer ile superior pankreatikoduodenal ven arasındaki portal venin altına yerleştirin (Şekil 2 ok).
10. Portal venin altındayken forsepsleri açın. İpliği kavrayın ve portal damarın altında ortalanacak şekilde dikkatlice çekin. Portal damarın etrafına sıkıca bastırmadan bir el düğümü atın.
11. Kavisli forsepsleri portal damarın altına yerleştirin ve damarı düzeltmek için yavaşça farenin kuyruğuna doğru çekin (Şekil 3A).
12. Kateter diğer elinizdeyken, iğnenin eğimini yüzü yukarı bakacak ve portal venin alt kısmına paralel olarak forsepslerin yakınına yerleştirin (Şekil 3B).
13. Damarı iğne ile nazikçe delin (Şekil 3C). İğnenin eğiminin damarın lümeninde olduğundan emin olun. Yaylı iğneyi geri çekin ve eğim venöz dallı alana yakın olana kadar polimer kateteri damar boyunca itmeye devam edin. Bu karaciğerin içindedir. Kateter doğru yerleştirilirse, kanın geri akışı görülecektir. (Şekil 3D).
14. El üstü düğümü sıkın ve stabilize etmeye yardımcı olmak için kateterin üzerine doğru çekin. Pompa hızını hemen 20 mL/dk'dan 4 mL/dk'ya düşürün ve drenaj için başka bir ana kan damarını kesin. En iyi sonuçlar için aort abdominalis'i kesin.
15. Borunun erkek ucunu kateterin dişi ucuna yerleştirin (Şekil 4A). Hatta hava kabarcığı olmadığından emin olun. Kateterin karaciğer içine veya damar dışına itilmemesine dikkat edin. İpliğin yerleştirilmesi önemli değildir, ancak damardan geri akışı önlemeye yardımcı olur ve kateteri doğru pozisyonda tutmaya yardımcı olur (Şekil 4B, C).
16. Hortumu alt ped üzerine hareketsiz hale getirmek için maskeleme bandı kullanın. Tüm kanın boşaldığından emin olmak için karaciğeri birkaç kez şişirmek için atık kan damarını sıkmak için düz forseps kullanın (Şekil 4D).
    not: Standart laboratuvar bandı çalışmayabilir; Bununla birlikte, maskeleme bandı ıslak koşullarda bile alt ped'e yapışmış kalacaktır.

3. Karaciğer perfüzyonu

1. Karaciğer PBS ile yıkanırken, yaklaşık 24 mg Kollajenaz Tip IV ölçün ve su banyosunda 45 mL Tampon 2 içeren şişeye yerleştirin. Kollajenazın tamamen çözülmesi için şişedeki sıvıyı döndürdüğünüzden emin olun ve şişenin sıvı içeren kısmı tamamen suya batırılacak şekilde şişeyi tekrar kelepçeye yerleştirin.
2. PBS ile yıkanırken karaciğerin rengindeki değişimi gözlemleyin. Çıkış borusunu 1 L'lik şişeden 125 mL'lik şişeye değiştirin. Hava kabarcıklarının karaciğere akmasına izin vermeyin.
3. Perfüzyon tamponu karaciğere ulaştığında, damar içinde bir miktar basınç oluşturmak için atık kan damarını kısaca sıkın ve bu sıvının karaciğerin tüm loblarını doldurmasına izin verin. Drenajı çok uzun süre kesmediğinizden emin olun, çünkü bu, karaciğeri çevreleyen ince bağ dokusunu (Glisson kapsülü) patlatabilir ve karaciğerin kılcal yatağı içindeki perfüzyonu veya sıvı akışını tahrip edebilir.
4. Kollajenaz içeren Tampon 2'nin, 45 mL'nin tamamı dokudan akana kadar karaciğerden perfüze olmasına izin verin.
   not: Başarılı olursa, Glisson kapsülü parankimden veya karaciğer dokusundan ayrılmalı ve karaciğerin kendisi amorf görünmelidir.
5. Diğer kristalleşme kabına yaklaşık 10 mL Tampon 1 ekleyin ve farenin yanına yerleştirin.
6. Kateteri çıkarın ve pompayı kapatın.
7. Düz forseps ve makasla karaciğeri fareden kesin. Kollajenaz sindirimi çok verimliyse, karaciğeri fareden almak ve Tampon 1'e yerleştirmek için temiz, steril bir kaşık bulundurmak gerekebilir.

Sonuçlar

Şekil 1: Perfüzyon süitinin şematik gösterimi. Şişeler kelepçelerle yerinde tutulur (gösterilmemiştir); sıvı içeren boru, prosedür sırasında 1 L'lik şişeden 125 mL'lik şişeye değiştirilir ve kırmızı noktalı çizgi ile temsil edilir. Oksijen beslemesinin doğrudan şişelerdeki çözeltilere kabarcıklanmadığına dikkat edin. Mantarlar ayrıca, boru çentiğin içine yerleştirildiğinde kapalı devre...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 L Erlenmeyer şişesi	Balıkçı Bilimsel	S63274 Serisi
250 mL Erlenmeyer şişesi	Balıkçı Bilimsel	S63271 Serisi
Silikon boru	Cole-Parmer	96400-14	Bu boru, şişelerden pompadan T konektörüne ve daha sonra katetere bağlı 1.0 mL şırıngaya kadar uzanır.
Tygon boru	Balıkçı Bilimsel	R3603	96400-14 arasında adaptör ve pipetler ve T konektörü olarak kullanılır. Bu aynı zamanda oksijen tüpü için de kullanılabilir.
T-konektörler	Cole-Parmer	EW-06294-82
Hızlı bağlantı kesme	Balıkçı Bilimsel	6150-0010
Sıkıştırma Kelepçeleri	Balıkçı Bilimsel	6165-0002
Masterflex L/S Değişken Hızlı Pompa; model 7553-70	Cole-Parmer	EW-07559-00	Değişken hızlı periplastik pompa
Pompa kafası; model 7014-20	Cole-Parmer	EW-07014-20
Cam dereceli 1,0 mL pipetler	Balıkçı Bilimsel	13-678
Kavisli tırtıksız makas	Güzel Bilim Araçları	14069-12
Dumont forseps	Güzel Bilim Araçları	11252-20
Kavisli forseps	Güzel Bilim Araçları	13009-12
10 mL şırınga	Balıkçı Bilimsel	03-377-23	Sadece şırınga fıçısına ihtiyaç duyulacaktır
Sterilize kaşık	Ev gereçleri mağazası
Pamuk topları	Ev gereçleri mağazası
Polyester dikiş ipliği	Ev gereçleri mağazası
Maskeleme bandı	Ev gereçleri mağazası
Başparmak raptiyeler	Ev gereçleri mağazası
Strafor ped	50 mL konik raf
Kurabiye / fırın tepsisi	Ev gereçleri mağazası
Emici alt pedler	Balıkçı Bilimsel	14-206-64
19 L su banyosu	Balıkçı Bilimsel	TSCOL19
BD Insyte Autogaurd Korumalı IV Kateter 24 ölçü	Becton Dickinson'ın fotoğrafı.	381412	Geri çekilebilir iğneli plastik kateter
Kristalize tabaklar 100x50	VWR (VWR)	89000-290
Polistiren petri kapları	Sigma Aldrich	P5481-500EA
50 mL konik borular	Balıkçı Bilimsel	12-565-270
Dereceli pipetler (5 mL)	Balıkçı Bilimsel	170355
Dereceli pipetler (25 mL)	Balıkçı Bilimsel	170357
EasyStrainer 100 μM	Greiner biyo-bir	542000	100 μm filtre
EasyStrainer 40 μM	Greiner biyo-bir	542040	40 μm filtre
Reaktif
ad	bileşik	Gram (g/L)	Milimolar (mM)
Tampon 1; pH 7.4	NaCl (Doğal)	8.3	142
	Kartal	0,5	6,7
	HEPES ÜNİVERSİTESİ	2.4	10
	Bsa	15	0,226
Tampon 2; pH 7.4	NaCl (Doğal)	3.9	66,74
	Kartal	0,5	6,71
	CaCl2	0,7	6,31
	HEPES ÜNİVERSİTESİ	24	100
	Bsa	15	0,226
	Fenol Kırmızısı	0,01	0,03
PBS; pH 7.4	NaCl (Doğal)	8	137
Kartal	0,2	2.7
Na2HPO4-7H2O	1,15	4.3
KH2PO4	0,2	1.4
DİĞER REAKTİFLER
ad	şirket	Katalog Numarası	Yorum
Kollajenaz Tip IV	Sigma Aldrich	C5138
İzofluran	Abcam Belediyesi	AB144581

arası Serisi arası arası · Serisi · Serisi (İngilizce)