Kanser Hücrelerinin İntraprostat Enjeksiyonu: Ortotopik Prostat Kanseri Fare Modeli Oluşturmak için Kanser Hücreleri Verme Tekniği

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

>1. Ameliyat Öncesi Fare Hazırlığı

NOT: Yeterli adaptasyonu sağlamak ve hayvan stresini en aza indirmek için ameliyattan en az bir hafta önce üniversite hayvan tesisinde ev fareleri. 1.1-1.6 adımları cerrahın asistanı tarafından gerçekleştirilir. Sonraki tüm cerrahi adımlar cerrah tarafından steril eldiven ve steril teknikle cerrahi aletler kullanılarak gerçekleştirilir.

1. Fareleri izofluran ile uyuşturun (hazne yoluyla indüksiyon için% 2-5, burun konisi yoluyla bakım için% 1-3). Ayak parmağı sıkıştırma refleksinin kaybıyla tam indüksiyonu doğrulayın.
2. Fareleri tartın ve en az 0.05 mg / kg analjezik buprenorfin sc
   uygulayın not: Fare ağırlığı ≥20 g, başarılı intra-prostat enjeksiyonları için idealdir.
3. Korneanın kurumasını önlemek için her iki göze de oftalmik merhem kayganlaştırıcı sürün.
4. Karnındaki tüm kürkleri tıraş edin.
5. Steril, yapışmayan pedler ve ardından steril alkollü mendiller kullanarak üç tur dairesel cerrahi ovma uygulamasıyla karnı sterilize edin. Karnın kurumasını bekleyin.
   not: Cerrahi prosedürün geri kalanında, sterilize edilmiş fare karnına temas etmek için sadece steril eldivenler ve cerrahi aletler kullanılmalıdır.
6. Fareyi sırtüstü yatırın, doğrudan temiz bir cerrahi mikroskop hedefi altında bir ısıtma yastığı üzerindeki temiz bir yüzeye aktarın.
7. Fareyi, karın üzerinde küçük bir delik açılmış steril bir örtü ile örtün.

2. Prostat İçi Enjeksiyon

NOT: Tüm cerrahi adımları steril koşullar altında gerçekleştirin. Mikroskobun, fare yerleşiminin veya steril olmayan diğer herhangi bir nesnenin ayarlanması ek yardım ile yapılmalıdır.

1. Penis ve preputial bezlerden daha üst olan karın orta hattı boyunca dış deride yaklaşık 1 cm'lik bir kesi yapın (Şekil 1D).
2. Dış karın derisi ile iç karın kas sistemi arasındaki bağ dokusunu, katmanlar arasındaki makası açarak ayırın.
3. Bağırsakların veya mesanenin delinmesini önlemek için kasları kaldırmak için forseps kullanarak iç karın kaslarında da benzer bir kesi yapın (Şekil 1D).
4. Genellikle arka, lateral ve mesaneden biraz üstün olan bilateral seminal veziküllerden (Şekil 1A, beyaz)/ön prostat loblarından (Şekil 1A, siyah) birini bulun, ancak bu fareler arasında değişebilir. Ön prostat lobları yarı saydamdır ve beyaz seminal veziküllerin daha küçük eğriliğine bağlıdır.
5. Seminal vezikülü delmeden doku üzerinde gerginlik oluşturmak için Graefe doku forsepsini kullanarak seminal vezikülün ucunu nazikçe kaldırın (Şekil 1E).
6. Myc-CaP matrigel solüsyonunu, hücreler peletlenmiş olabileceğinden, gentil pipetleme (cerrah asistanı tarafından gerçekleştirilir) ile karıştırın ve hava kabarcıklarını önlemek için iğneye 30 μL (1x10⁶ hücre) yavaşça aspire edin.
7. İğnenin eğimini ön prostat lobunun uzun eksenine paralel olarak dikkatlice yerleştirin. Lobuna yavaşça 30 μL enjekte edin ve ardından sızıntıyı önlemek için iğneyi yavaşça geri çekin (Şekil 1F). Ön prostat lobunu büyüterek yeterli enjeksiyonu doğrulayın (Şekil 1G).
8. Matrijelin lob içinde kısmen katılaşmasına izin vermek için seminal vezikülü ve prostat lobunu farenin dışında yaklaşık 30 saniye dikkatlice tutun. Bu süre zarfında, enjekte edilen prostat lobuna bastırmadan ortotopik olmayan tümör gelişimini önlemek için steril bir polyester uçlu aplikatör kullanarak karın içindeki herhangi bir hücre çözeltisi sızıntısını toplayın.
9. Seminal vezikülü ve enjekte edilen prostat lobunu, lob üzerine baskı yapmadan dikkatlice karın içine geri koyun. Dışlanmış dokuları değiştirin.
10. 5-0 vicryl emilebilir ters kesme iğneli dikişler ile iç karın kaslarını kapatmak için sürekli dikişler atın.
11. 4-0 naylon monofilament emilmeyen ters kesme iğneli dikişler ile dış karın derisini kapatmak için kesikli dikişler atın. not: Dış karın derisini kapatmak için sterilize edilmiş 9 mm'lik zımbalar da kullanılabilir. Bununla birlikte, sütürlerin aksine, sonraki herhangi bir biyolüminesan ve floresan tümör görüntüleme sinyaline müdahale ederler.
12. Tüm aletleri steril etanol mendillerle (cerrahın asistanı tarafından açılır) temizleyin ve 30 saniye boyunca bir cam boncuk sterilizatörüne koyun. Bir sonraki farede kullanmadan önce aletlerin kurumasını bekleyin.
13. Kalıntı matrigel ile tıkanmayı önlemek için şırıngayı ve iğneyi steril salinle (cerrahın asistanı tarafından açılır) yıkayın.
    not: Tüm operasyonlar için bir cerrah asistanı bulunmalı, steril olmayan tüm ameliyat öncesi fare hazırlığı ve ameliyat sonrası fare bakımını gerçekleştirmeli ve ayrıca enjeksiyonlardan önce Myc-CaP matrigel solüsyonunu karıştırmalıdır. Süreyi en aza indirmek için, her intra-prostatik fare prosedürü 20-30 dakika gerektireceğinden, cerrah mevcut fareyi dikerken cerrah asistanı bir sonraki fareyi hazırlamaya başlayabilir.

>3. Ameliyat Sonrası Fare Bakımı

1. 1 mg / kg analjezik meloksikam sc uygulayın hemen, ameliyattan 24 saat ve 48 saat sonra.
2. Farelerin, bir ısıtma yastığının yarısına kadar yerleştirilmiş yatak takımı olmayan bir kafeste iyileşmesine izin verin. Fareleri ameliyattan sonra normal hareketlilik ve aktiviteyi yeniden kazanana kadar en az 30 dakika izleyin, ardından onları kafesin zeminindeki yiyeceklerle birlikte temiz bir kafese koyun.
3. Ameliyattan sonra uygun yara iyileşmesi, vücut ağırlığı, tımar ve ambulasyon için fareleri günlük olarak daha fazla izleyin. Herhangi bir dövüş kanıtı üzerine fareleri ayrı kafeslere ayırın.
4. Ameliyattan sonraki 14 gün içinde kalan dikişleri çıkarın.

Şekil 1: Ön prostat lobu, drenaj lenf düğümleri ve prostat içi hücre enjeksiyonları için temsili teknik. (A) sağ ön prostat lobu (siyah, *), yapışık sağ seminal vezikül (beyaz), sağ testis ve yağ yastıkçığı (yeşil) ve mesane (sarı), (B) bilateral prostat boşaltan para-aortik lenf düğümleri (turuncu), (C) mikro diseksiyon makası, Graefe forseps, Graefe doku forsepsleri, dikiş kesicili bir iğne tutucu ve 28 gauge iğneli 50 μL şırınga (soldan sağa), (D) orta hat insizyonları, (E) seminal vezikül ve ön prostat lobunun dışsallaştırılması, (F) prostat içi enjeksiyon ve (G) ön prostat lobunun büyütülmesi.