Mikroglial Fagositoz Testi: iPSC Makrofajları Kullanılarak Nöroblastom Hücreleri için Mikroglial Fagositoz Modeli Oluşturmak İçin İn Vitro Test

Özet

Kaynak: Hall-Roberts, H. et al. iPSC-Makrofajlar ile Ölü Nöroblastom Hücrelerinin Fagositozu için İn vitro Kantitatif Görüntüleme Testi. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu videoda, indüklenmiş pluripotent kök hücreler kullanarak nöroblastom için mikroglial fagositoz testini gerçekleştiriyoruz. Test, nörodejeneratif hastalıklarda mikroglial fonksiyonun bozulmasını değerlendirmeye yardımcı olur.

Protokol

1. Ölü SH-SY5Y'lerin pH'a duyarlı Kırmızı Floresan Boya ile Etiketlenmesi

1. Fenol kırmızısı içermeyen HEPES tamponlu ortamda süspanse edilmiş sabit SH-SY5Y hücreleri ile başlayın. Hücreleri sayın ve gereken toplam hücre sayısını 2 mL düşük protein bağlayıcı bir tüpe çıkarın. Her 1 milyon SH-SY5Y için, fenol kırmızısı içermeyen HEPES tamponlu ortam ile 2 mL'lik tüpteki toplam hacmi 300-500 μL'ye kadar tamamlayın. Tüpü 37 °C'lik bir su banyosunda kısa bir süre ısıtın.
2. PH'a duyarlı kırmızı floresan boya STP esterini sulandırın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve ılık 2 mL hücre tüpüne milyon SH-SY5Y başına 12,5 μg boya ekleyin. Pipetleme ile nazikçe karıştırın. Tüpü oda sıcaklığında, ışıktan koruyarak 30 dakika inkübe edin.
   not: pH'a duyarlı boyanın STP ester türleri, birincil aminlerle reaksiyona girer ve bu nedenle, etiketleme tamponu serbest aminler içermemelidir. Sulu tamponlarda potansiyel olarak sınırlı çözünürlük nedeniyle, DMSO ile çözünmüş boyayı sadece sulu tamponu ısıtmak için ekleyin, hemen karıştırın ve çökelti belirtileri (ışık mikroskobu altında koyu renkli parçacıklar) olup olmadığını inceleyin.
3. 1 mL HBSS ekleyin ve 4 ° C'de 7 dakika boyunca 1200 x g'da santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve 2 mL HBSS ile yıkayın. Santrifüjlemeyi tekrarlayın.
4. Süpernatanı atın ve hücreleri fenol kırmızısı içermeyen makrofaj ortamında (Malzeme Tablosuna bakınız) 200.000-1.2 milyon hücre / mL konsantrasyona yeniden süspanse edin, böylece 50 μL 10.000-60.000 hücre olur (yani, iPSC-makrofajlardan 0.5x-3x daha fazla SH-SY5Ys).
   not: Ortamdaki fenol kırmızısı, arka plan floresansını artırır ve bu nedenle, canlı hücre görüntüleme yapılacaksa fenol kırmızısı içermeyen ortam kullanılmalıdır. Lekeli SH-SY5Y'lerin birkaç saatten fazla saklanması, değerlendirilmediği için önerilmez. Lekeli SH-SY5Ys'yi buz üzerinde tutun ve ışıktan koruyun.

2. iPSC-makrofajların boyanması

1. Biyolojik bir güvenlik kabininde, koyu kırmızı floresan, hücre geçirgen, süksinimidil ester-reaktif boyanın makrofaj ortamında bir çözelti hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu). Hoechst 33342'yi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın). Çalışma solüsyonunu bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın.
2. Hücre süpernatanını çok kanallı bir pipetle steril bir rezervuara pipetleyerek iPSC-makrofaj ortamını nazikçe aspire edin. Adım 2.1'de hazırlanan boya çözeltisinin 70 μL/oyuğunu çok kanallı bir pipet kullanarak iPSC-makrofajlara ekleyin. 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 1 saat inkübe edin.
3. Fenol kırmızısı içermeyen makrofaj ortamında deneysel tedaviler hazırlayın. Negatif kontrol tedavisi olarak 10 μM sitokalasin D ekleyin. İnkübasyon sonrası, iPSC-makrofaj ortamını çok kanallı bir pipetle çok nazikçe aspire edin ve yıkamak için 100 μL / kuyu Hank'in tamponlu salin solüsyonu (HBSS) ekleyin. HBSS'yi nazikçe pipetleyerek hemen çıkarın, ardından 100 μL ortam ± bileşikler ekleyin. 37 ° C'de 10 dakika - 1 saat inkübe edin ve% 5 CO₂.
   not: Sitokalasin D, güçlü bir aktin inhibitörüdür ve fagositozu bloke eder. Daha uzun inkübasyon gerektiren herhangi bir deneysel tedavi için, ör., 24-72 saat, tam makrofaj ortamında 100 μL / tedavi kuyusu kullanarak adım 2.1'den önce deneysel tedaviyi gerçekleştirin. Protokole göre 2.1-2.3 adımlarını izleyin, böylece hücre boyama gerçekleştirilir ve daha sonra tedavi, fagositoz testinin geri kalanı için fenol kırmızısı içermeyen makrofaj ortamında yeniden uygulanır.

3. Görüntüleme Fagositozu

1. Sabit hücreli yüksek içerikli görüntüleme
   1. Kuyucuk başına 50 μL etiketli SH-SY5Ys eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın ve sıvının kenarındaki her bir oyuğun yanına ekleyin. 37 ° C ve% 5 CO_2'de 3-5 saat inkübe edin.
   2. Fagositoz inkübasyonundan sonra, çok kanallı bir pipetle pipetleyerek hücre süpernatantlarını nazikçe aspire edin ve atın. 100 μL PBS ile bir kez yıkayın.
   3. Plakayı 100 μL% 2 paraformaldehit ekleyerek sabitleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
   4. Kuyuları aspire edin ve 100 μL PBS ekleyin. Plaka kapatıcı ve folyo ile örtün; İhtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklayın.
      not: Tahlil plakası, önemli bir sinyal bozulması olmadan en az bir hafta bu şekilde saklanabilir; Daha uzun depolama alanı test edilmemiştir.
   5. Yüksek içerikli görüntüleme mikroskobunu açın (Malzeme Tablosuna bakın) ve görüntü yakalama yazılımını açın. Ekranın üst kısmındaki Yükle simgesine tıklayarak tahlil plakasını mikroskoba yükleyin.
   6. Kurulum sekmesini seçin. Sol üst kutunun açılır menülerinde: uygun plaka tipini seçin, otomatik odaklama seçeneğini seçin İki Tepe (Varsayılan), objektif 40x Su, NA1.1'i seçin, Konfokal modu seçin ve 1'in gruplamasını seçin.
   7. Kullanmadan önce Ayarlar menüsü aracılığıyla 40x su hedefini yıkayın.
   8. Kanal Seçimi kutusunda, DAPI, Alexa 647 ve Alexa 568 kanallarını eklemek için + simgesini kullanın. Bunları 1 μm'lik tek bir düzlemde ölçecek şekilde ayarlayın. Tahlil plakasının boyama verimliliği için Zaman ve Güç ayarlarını optimize edin.
      not: Kılavuz olarak, DAPI'yi 200 ms pozlama ve %100 güç, Alexa 647'yi 1500 ms maruz kalma ve %100 güç ve Alexa 568'i 100 ms maruz kalma ve %40 güç olarak ayarlayın.
   9. Kanalları ayırmak için Kanal Sırası'na tıklayarak kanalların aynı anda ölçülmediğinden emin olun.
   10. Navigasyon Bölümünde | Yerleşimi tanımlayın, ölçüm kuyucuklarını seçin ve kuyu başına 9-12 alan seçin.
   11. Kurulum sırasında, plaka haritasındaki temsili bir alana tıklayın ve kanal ofsetini ayarlayarak lekelenmenin mevcut olduğundan ve görüntülerin odaklandığından emin olmak için her bir ölçüm kanalını sırayla kontrol edin.
   12. Verilerin uzaktan analiz için bir sunucuya yüklenmesi için, Çevrimiçi İşler kutusuna ve ilgili ekran adına tıklayın; bu, görüntülemeden sonra verilerin bir sunucuya otomatik olarak yüklenmesini sağlayacaktır.
   13. Kaydet düğmesine tıklayarak tahlil protokolünü kaydedin.
   14. Üst kısımdaki Deneyi Çalıştır sekmesine tıklayın ve deney plakasını adlandırın, ardından Başlat'a tıklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
15 mL konik santrifüj tüpü	doğan	352096	Hücrelerin santrifüjlenmesi için
2-20 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL tek kanallı mikropipetler
PBS'de %4 paraformaldehit	Alfa Aesar	J61899	Hücrelerin sabitlenmesi için
6 oyuklu plaka, doku kültürü ile tedavi edildi
AggreWell-800 24 oyuklu plaka	KÖK HÜCRE Teknolojileri	34815	Embriyoid cisimciklerinin oluşumu için mikro kuyu düşük yapışmalı 24 oyuklu plaka
Otomatik hücre sayacı
Tezgah üstü santrifüj
Tezgah üstü mikrosantrifüj
CellCarrier-96 Ultra Mikroplakalar, doku kültürü ile işlenmiş, siyah, 96 oyuklu kapaklı	Perkin Elmer	6055302	Fagositoz tahlili için 96 oyuklu doku kültürü (TC) ile tedavi edilmiş, siyah kuyu duvarlı ve optik olarak şeffaf bir tabana sahip mikroplaka
CellProfiler yazılımı			Canlı hücre hızlandırılmış mikroskop ile elde edilen fagositoz görüntülerinin analizi için açık kaynaklı yazılım. Web sitesinden (http://cellprofiler.org/) ücretsiz indirin, bu protokol 2.2.0 sürümünü kullandı.
CellTracker Koyu Kırmızı boya	Termo Balıkçı	C34565	iPS-makrofajların sitoplazmasını boyamak için koyu kırmızı floresan, hücre geçirgen, süksinimidil ester-reaktif boya. CellTracker Deep Red boyasını DMSO'da 2 mM'ye (1.4 mg / mL) çözün. DMSO stoğunun Makrofaj ortamı ile seyreltilmesiyle 1 μM'de kullanın.
Class 2 laminer hava akışı güvenlik kabini
CO2 gaz şişesi			EVOS FL Auto için aksesuar
CO2 inkübatör, 37°C'ye ve %5 CO2'ye ayarlanmış
Sitokalasin D	Kayman	11330	Fagositoz testi için negatif kontrol tedavisi. DMSO'da 10 mM'ye sulandırın ve alikotları -20 ° C'de saklayın, daha fazla donma-çözülme döngüsünden kaçının. Son konsantrasyonda 10 μM'de kullanın.
DMEM/F12	Gibco (Gibco)	11320074	SH-SY5Y ortamının bileşeni
DMSO (Türkçe)	Sigma	D8418	CellTracker ve pHrodo boyaları için çözücü
Fetal Sığır Serumu	Sigma	F4135	SH-SY5Y ortamının bileşeni
Geltrex LDEV-Free, hESC Nitelikli, Azaltılmış Büyüme Faktörlü Bazal Membran Matrisi	Canlandırıcı	A1413302	iPSC kültürü için hESC nitelikli bazal membran matrisi
GlutaMAX Takviyesi	Gibco (Gibco)	35050-038	Hem Fabrika hem de Makrofaj ortamının bileşeni
HBSS (Türkçe)	Fransa	10-547F OLUN	Yıkama adımları için Hank'in dengeli tuz çözeltisi
İnsan rekombinant IL-3	Gibco (Gibco)	PHC0033	Hem Fabrika hem de Makrofaj ortamının bileşeni
Canlı Hücre Görüntüleme Çözümü	Termo Balıkçı	A14291DJ	Ölü SH-SY5Y'leri etiketlemek için fenol kırmızısı içermeyen HEPES tamponlu ortam
Düşük protein bağlayıcı 2 mL tüpler	Eppendorf Belediyesi	30108.132	SH-SY5Ys'yi boyamak için
M-CSF (Mali İşler Örgütü)	Termo Balıkçı	PHC9501	Hem Fabrika hem de Makrofaj ortamının bileşeni
mTeSR1 Orta	KÖK HÜCRE Teknolojileri	85850	iPSC ortamı
Çok kanallı 20-200 uL pipet			96 oyuklu plakanın sıvı işlemesi için
NucBlue Live ReadyProbes Reaktifi	Termo Balıkçı	R37605	iPS-makrofajların çekirdeklerini boyamak için damlalıklı bir şişede Hoechst 33342 formülasyonu, Makrofaj ortamında 0.5 damla / mL kullanın.
Opera Phoenix Yüksek İçerikli Tarama Sistemi	Perkin Elmer	HH14000000	Harmony yazılım sürümü 4.9 ile kullanılan yüksek içerikli görüntüleme mikroskobu.
Penisilin-Streptomisin	Gibco (Gibco)	15140-122	Fabrika, Makrofaj ve SH-SY5Y ortamının bileşeni
pHrodo iFL Kırmızı STP-Ester	Termo Balıkçı	P36011 Serisi	Ölü SH-SY5Ys'yi etiketlemek için pH'a duyarlı kırmızı floresan boya. pHrodo iFL Kırmızı STP Ester tozunu DMSO'da 5 mg / mL konsantrasyona kadar sulandırın. Her 1 milyon SH-SY5Y için, Canlı Hücre Görüntüleme Solüsyonunda süspanse edilmiş önceden ısıtılmış hücrelere 2,5 μL (12,5 μg) pHrodo iFL Red STP Ester stoğu ekleyin.
Serolojik pipet dolgusu
T175 şişesi, doku kültürü ile tedavi edildi			"Fabrikalar" olarak bilinen iPSC-makrofaj öncülerinin farklılaşması için gemi
T75 şişesi			SH-SY5Y kültürü için kap
Şeffaf plaka kapatıcılar	Greiner Bio-Bir	676001	Tahlil plakasının depolanması ve taşınması için
Su banyosu, 37°C'ye ayarlanmış
X-VIVO 15 Medium, L-glutamin, gentamisin ve fenol kırmızısı içerir	Fransa	BE04-418F	Fabrika ve Makrofaj ortamının bileşeni
X-VIVO 15 Medium, L-glutamin içeren; gentamisin veya fenol kırmızısı içermez	Fransa	04-744Ç	Katkı maddeleri veya büyüme faktörleri olmadan fagositozda kullanım için fenol kırmızısı içermeyen makrofaj ortamı

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi