Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
3.5K görüntülenme
⸱
30 Nisan 2023
Kaynak: Hall-Roberts, H. et al. iPSC-Makrofajlar ile Ölü Nöroblastom Hücrelerinin Fagositozu için İn vitro Kantitatif Görüntüleme Testi. J. Vis. Uzm. (2021)
Bu videoda, indüklenmiş pluripotent kök hücreler kullanarak nöroblastom için mikroglial fagositoz testini gerçekleştiriyoruz. Test, nörodejeneratif hastalıklarda mikroglial fonksiyonun bozulmasını değerlendirmeye yardımcı olur.
1. Ölü SH-SY5Y'lerin pH'a duyarlı Kırmızı Floresan Boya ile Etiketlenmesi
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 15 mL konik santrifüj tüpü | doğan | 352096 | Hücrelerin santrifüjlenmesi için |
| 2-20 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL tek kanallı mikropipetler | |||
| PBS'de %4 paraformaldehit | Alfa Aesar | J61899 | Hücrelerin sabitlenmesi için |
| 6 oyuklu plaka, doku kültürü ile tedavi edildi | |||
| AggreWell-800 24 oyuklu plaka | KÖK HÜCRE Teknolojileri | 34815 | Embriyoid cisimciklerinin oluşumu için mikro kuyu düşük yapışmalı 24 oyuklu plaka |
| Otomatik hücre sayacı | |||
| Tezgah üstü santrifüj | |||
| Tezgah üstü mikrosantrifüj | |||
| CellCarrier-96 Ultra Mikroplakalar, doku kültürü ile işlenmiş, siyah, 96 oyuklu kapaklı | Perkin Elmer | 6055302 | Fagositoz tahlili için 96 oyuklu doku kültürü (TC) ile tedavi edilmiş, siyah kuyu duvarlı ve optik olarak şeffaf bir tabana sahip mikroplaka |
| CellProfiler yazılımı | Canlı hücre hızlandırılmış mikroskop ile elde edilen fagositoz görüntülerinin analizi için açık kaynaklı yazılım. Web sitesinden (http://cellprofiler.org/) ücretsiz indirin, bu protokol 2.2.0 sürümünü kullandı. | ||
| CellTracker Koyu Kırmızı boya | Termo Balıkçı | C34565 | iPS-makrofajların sitoplazmasını boyamak için koyu kırmızı floresan, hücre geçirgen, süksinimidil ester-reaktif boya. CellTracker Deep Red boyasını DMSO'da 2 mM'ye (1.4 mg / mL) çözün. DMSO stoğunun Makrofaj ortamı ile seyreltilmesiyle 1 μM'de kullanın. |
| Class 2 laminer hava akışı güvenlik kabini | |||
| CO2 gaz şişesi | EVOS FL Auto için aksesuar | ||
| CO2 inkübatör, 37°C'ye ve %5 CO2'ye ayarlanmış | |||
| Sitokalasin D | Kayman | 11330 | Fagositoz testi için negatif kontrol tedavisi. DMSO'da 10 mM'ye sulandırın ve alikotları -20 ° C'de saklayın, daha fazla donma-çözülme döngüsünden kaçının. Son konsantrasyonda 10 μM'de kullanın. |
| DMEM/F12 | Gibco (Gibco) | 11320074 | SH-SY5Y ortamının bileşeni |
| DMSO (Türkçe) | Sigma | D8418 | CellTracker ve pHrodo boyaları için çözücü |
| Fetal Sığır Serumu | Sigma | F4135 | SH-SY5Y ortamının bileşeni |
| Geltrex LDEV-Free, hESC Nitelikli, Azaltılmış Büyüme Faktörlü Bazal Membran Matrisi | Canlandırıcı | A1413302 | iPSC kültürü için hESC nitelikli bazal membran matrisi |
| GlutaMAX Takviyesi | Gibco (Gibco) | 35050-038 | Hem Fabrika hem de Makrofaj ortamının bileşeni |
| HBSS (Türkçe) | Fransa | 10-547F OLUN | Yıkama adımları için Hank'in dengeli tuz çözeltisi |
| İnsan rekombinant IL-3 | Gibco (Gibco) | PHC0033 | Hem Fabrika hem de Makrofaj ortamının bileşeni |
| Canlı Hücre Görüntüleme Çözümü | Termo Balıkçı | A14291DJ | Ölü SH-SY5Y'leri etiketlemek için fenol kırmızısı içermeyen HEPES tamponlu ortam |
| Düşük protein bağlayıcı 2 mL tüpler | Eppendorf Belediyesi | 30108.132 | SH-SY5Ys'yi boyamak için |
| M-CSF (Mali İşler Örgütü) | Termo Balıkçı | PHC9501 | Hem Fabrika hem de Makrofaj ortamının bileşeni |
| mTeSR1 Orta | KÖK HÜCRE Teknolojileri | 85850 | iPSC ortamı |
| Çok kanallı 20-200 uL pipet | 96 oyuklu plakanın sıvı işlemesi için | ||
| NucBlue Live ReadyProbes Reaktifi | Termo Balıkçı | R37605 | iPS-makrofajların çekirdeklerini boyamak için damlalıklı bir şişede Hoechst 33342 formülasyonu, Makrofaj ortamında 0.5 damla / mL kullanın. |
| Opera Phoenix Yüksek İçerikli Tarama Sistemi | Perkin Elmer | HH14000000 | Harmony yazılım sürümü 4.9 ile kullanılan yüksek içerikli görüntüleme mikroskobu. |
| Penisilin-Streptomisin | Gibco (Gibco) | 15140-122 | Fabrika, Makrofaj ve SH-SY5Y ortamının bileşeni |
| pHrodo iFL Kırmızı STP-Ester | Termo Balıkçı | P36011 Serisi | Ölü SH-SY5Ys'yi etiketlemek için pH'a duyarlı kırmızı floresan boya. pHrodo iFL Kırmızı STP Ester tozunu DMSO'da 5 mg / mL konsantrasyona kadar sulandırın. Her 1 milyon SH-SY5Y için, Canlı Hücre Görüntüleme Solüsyonunda süspanse edilmiş önceden ısıtılmış hücrelere 2,5 μL (12,5 μg) pHrodo iFL Red STP Ester stoğu ekleyin. |
| Serolojik pipet dolgusu | |||
| T175 şişesi, doku kültürü ile tedavi edildi | "Fabrikalar" olarak bilinen iPSC-makrofaj öncülerinin farklılaşması için gemi | ||
| T75 şişesi | SH-SY5Y kültürü için kap | ||
| Şeffaf plaka kapatıcılar | Greiner Bio-Bir | 676001 | Tahlil plakasının depolanması ve taşınması için |
| Su banyosu, 37°C'ye ayarlanmış | |||
| X-VIVO 15 Medium, L-glutamin, gentamisin ve fenol kırmızısı içerir | Fransa | BE04-418F | Fabrika ve Makrofaj ortamının bileşeni |
| X-VIVO 15 Medium, L-glutamin içeren; gentamisin veya fenol kırmızısı içermez | Fransa | 04-744Ç | Katkı maddeleri veya büyüme faktörleri olmadan fagositozda kullanım için fenol kırmızısı içermeyen makrofaj ortamı |
