Taze Donmuş Glioma Dokularından Çekirdek İzolasyonu: Glioma Tümör Örneklerinden Sağlam Çekirdek Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Narayanan, A. et al. Tek Çekirdekli RNA-seq ve ATAC-seq için Taze Donmuş Beyin Tümörlerinden Çekirdek İzolasyonu. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, taze donmuş glioma dokusundan tek çekirdekleri izole etmek için kullanılan protokol açıklanmaktadır. İzole edilmiş tek çekirdekler, merkezi sinir dokularının gliomunda gözlenen tümörler arası ve tümör içi heterojenlik hakkında daha derin bilgiler elde etmek için tek çekirdekli RNA (snRNA) dizilemesi ve Transpozaz Erişilebilir Kromatin (snATAC) dizilemesi için tek çekirdekli Test gibi dizileme teknikleri için örnekler olarak kullanılabilir.

Protokol

1. Doku Diseksiyonu ve Dissosiyasyonu

1. Taze donmuş doku örneğini (10-60 mg) önceden soğutulmuş bir Petri kabına aktarın. Taze donmuş dokuyu bir tıraş bıçağıyla buz üzerinde küçük parçalar halinde kıyın/doğrayın.
2. Önceden soğutulmuş 1,5 mL'lik bir tüpe 500 μL soğutulmuş çekirdek lizis tamponu ekleyin. Doku parçalarını çekirdek lizis tamponunu içeren 1,5 mL'lik tüpe yerleştirin ve bir Douncer'a (Malzeme Tablosu) aktarın.
   not: İki Dounce homojenizatör tokmağı vardır: ilk numune azaltımı için "gevşek" veya "A" tokmak ve tam numune homojenizasyonu için "sıkı" veya "B" tokmak.
3. Sürtünme azalana kadar doku parçalarını "gevşek" havaneli ile yaklaşık 20 vuruş boyunca vurun. Kalıntı varsa, numune 100 mm'lik bir süzgeç ile filtrelenerek önceden temizlenebilir.
4. Tam doku homojenizasyonu elde etmek için "sıkı" havaneli ile 20 vuruş boyunca zıplayın.
5. Homojenatı (yaklaşık 500 μL) önceden soğutulmuş 2 mL'lik bir tüpe aktarın. 1 mL soğutulmuş lizis tamponu ekleyin. Yavaşça karıştırın ve 5 dakika buz üzerinde inkübe edin. Geniş delikli bir pipet ucuyla nazikçe karıştırın ve inkübasyon sırasında 1-2 kez tekrarlayın.
6. 30 μm'lik bir süzgeç ağı kullanarak tüm homojenatı filtreleyin, 15 mL'lik bir Falcon tüpüne toplayın ve önceden soğutulmuş 2 mL'lik yeni bir tüpe geri aktarın. Tüm homojenat için tipik olarak tek bir süzgeç yeterlidir.
7. Büyük döküntülerin çıkarıldığını ve nükleer zarın sağlamlığını doğrulamak için ışık mikroskobu altında kontrol edin. Çekirdeklerin yuvarlak olması ve nükleer zarın bozulmaması gerekir. Kalıntı varsa, çekirdekler yeniden filtrelenebilir.
8. Çekirdekleri tezgah üstü bir santrifüjde 500 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın, çekirdekleri içeren bir pelet ile ~ 50 μL'yi geride bırakın. Peleti başka bir 1 mL çekirdek lizis tamponunda nazikçe yeniden süspanse edin ve buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.
9. Çekirdekleri 500 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatanı çıkarın, 500 mL 1x homojenizasyon tamponu (HB) ekleyin (Tablo 1) ve yeniden süspanse etmeden 5 dakika inkübe edin. Ardından, çekirdekleri başka bir 1.0 mL 1x HB içinde yeniden süspanse edin.
10. Çekirdekleri 500 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve çekirdekleri 200 μL 1x HB'de yeni bir 2.0 mL tüpe yavaşça yeniden süspanse edin.

    Tablo 1: 1x Homojenizasyon Tamponu Kararsız Çözeltinin Hazırlanması (numune başına 2 mL)

    numaralı kripto para birimi

    >1x Homojenizasyon Tamponu Kararsız Çözelti (numune başına 2 mL)
    reaktif	Son Danışmanlık.	Numune başına hacim (μL)
    6x Homojenizasyon Tamponu Kararsız	1 katı	333,33
    1 m sükroz	320 milyon	640,00
    50 mM EDTA	0,1 milyon	4,00
    % 10 NP40	%0,1	20.00
    H2O		1006,27

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2-Merkaptoetanol	Sigma	M6250
CaCl2	Sigma	21115-100ML
Erozyon (0,5 M)	Termo Bilimsel	R1021
Falcon 15 mL Konik Santrifüj Tüpleri	Balıkçı Bilimsel	352096
MACS Akıllı Tutucular (100 μm)	Miltenyi Biyotec	130-098-463
Mg(Ac)2	Sigma	63052-100ML
NP-40	Abcam Belediyesi	ab142227
Nuclei İzolasyon Kiti: Nuclei EZ Prep	Sigma	NUC101-1KT
Güvenli kilit tüpleri 1,5 mL	Eppendorf Belediyesi	30120086
Güvenli kilit tüpleri 2.0 mL	Eppendorf Belediyesi	30120094
Sakaroz	Sigma	S0389 Serisi
Geniş Geçişli pipet uçları (1000 μL)	Themo Fisher Bilimsel	2079 Küresel Rekabet Kurumu

Serisi Serisi Serisi (İngilizce) Serisi