$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Gradyan Santrifüjleme
- % 25 iyodiksanolün nihai konsantrasyonunu vermek için 200 μL% 50 iyodiksanol çözeltisi (Tablo 1) ekleyin. 300 mL'ye ayarlanmış bir pipetle 10 kez iyice karıştırın.
- % 25'lik karışımın altına 300 μL %29 iyodiksanol çözeltisi (Tablo 2) ekleyin. Katmanların karışmasını önlemek için P1000 ince bir uç kullanın.
- % 29'luk karışımın altına 300 μl% 35 iyodiksanol çözeltisi (Tablo 3) ekleyin. Katmanların karışmasını önlemek için P1000 ince uç kullanın.
Dikkat: Bu adım, aşırı hacim yer değiştirmesini önlemek için pipetleme sırasında pipet ucunun kademeli olarak çıkarılmasını gerektirir.
- Numuneleri sallanan bir kova santrifüjüne yerleştirin, fren kapalıyken 4°C'de 3.500 x g'de 20 dakika döndürün.
- Numuneleri sallamadan nazikçe çıkarın ve ışık altında gözlemleyin. İkinci ve üçüncü katman arasında %95 saf çekirdeklerden oluşan berrak beyaz bir bant görünür olmalıdır (Şekil 1).
2. Çekirdeklerin İzolasyonu
- Üst katmanları, %29-35 interfazda beyaz çekirdek bandına kadar aspire edin.
- Çekirdek bandını 200 mL'lik bir hacimde toplayın, yeni bir tüpe aktarın ve 20 μm'lik bir filtre ile filtreleyin (Malzeme Tablosu).
not: Filtrasyondan önce çekirdeklerin yeniden askıya alınmasına gerek yoktur.
- Büyük döküntülerin çıkarıldığını ve nükleer zarın sağlamlığını doğrulamak için ışık mikroskobu altında kontrol edin. Çekirdeklerin yuvarlak olması ve nükleer zarın bozulmaması gerekir.
- Bir hemositometrede Tripan mavisi boyamayı kullanarak çekirdekleri ve snRNA-seq/snATAC-seq için alikot çekirdeklerini sayın.
Tablo 1: 6x Homojenizasyon Tamponu Kararlı Master Karışımının Hazırlanması
| 6x Homojenizasyon Tamponu Kararlı Master Karışımı |
| reaktif | Son Danışmanlık. | 100 (mL) için hacim |
| 1 M CaCl₂ | 30 milyon | 3,0 |
| 1 M Mg(Ac)₂ | 18 milyon | 1.8 |
| 1 m tris pH 7.8 | 60 milyon | 6,0 |
| H₂O | | 89,2 |
| Oda sıcaklığında tutunuz, doğrudan ışığa maruz kalmaktan kaçının |
Tablo 2: 1 M sükrozun hazırlanması
| 1 m sükroz |
| 34.23 g sükroz |
| 78,5 mL suda çözünür |
| 100 mL'ye kadar su ile doldurun |
Tablo 3: 6x Homojenizasyon Tamponu Kararsız Çözeltinin Hazırlanması (numune başına 650 μL)
| 6x Homojenizasyon Tamponu Kararsız Çözelti (numune başına 650 mL) |
| reaktif | Son Danışmanlık. | Numune başına hacim (μL) |
| 6x Homojenizasyon Tamponu Kararlı | 6 katı | 648,84 |
| 100 mM PMSF (Fenilmetilsülfonil florür) | 0,1 milyon | 1,08 |
| 14,3 M β-merkaptoetanol | 1 milyon | 0,08 |
