Donmuş Fare Beyin Dokusu Kesiti: Donmuş Murin Beyin Dokusundan İnce Donmuş Doku Kesitleri Elde Etme Prosedürü

Özet

Kaynak: Comba, A. et al. İntratümöral heterojenliğin, onkostreamlerin ve invazyonun uzamsal ve moleküler karakterizasyonu için glioma alt bölgelerinin lazer yakalama mikrodiseksiyonu. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, donmuş bir fare beyin tümörü dokusunun bir kriyostat kullanılarak kesitini gösteriyoruz. Bu şekilde elde edilen donmuş beyin dokusu bölümleri, daha fazla analize kadar düşük sıcaklıklarda saklanır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Donmuş Beyin Tümörü Dokularının Kesitlenmesi

1. 2 μm polietilen naftalat (PEN) slaytlarını numune bilgileriyle etiketleyin. Doku kesitleri, kesit alındıktan sonra doğrudan bu slaytların üzerine yerleştirilecektir.
2. Kriyostat odasının sıcaklığını -20 ila -24 °C arasında ayarlayın. Bölümlere ayırmadan önce, numune bloğunu kriyostat odasına yerleştirin ve 30-60 dakika boyunca odadaki sıcaklığa dengelenmesini bekleyin.
3. Kriyostat haznesini ve bıçak tutucuyu %100 etanol ile temizleyin ve kullanılacak fırçalara RNase temizleme solüsyonu püskürtün. Kriyostat odasının içinde çalışarak kalıbı çıkarın ve beyni içeren OCT bloğunu OCT ile kriyostat numune diskine takın. Bloğu disk tutucuya yerleştirin ve bloğu bıçak bıçağıyla hizalayın.
4. Kesit tutucusuna tek kullanımlık bir bıçak takın.
5. Beyni 10 μm kalınlığında bölümlere ayırın. Dokuda çizgi veya çizik çizgisi olmadığından emin olun. Bir boya fırçası kullanarak, dokuyu dikkatli bir şekilde düzleştirin ve kesme yüzeyine açın.
6. Beyin bölümlerini içeren dokuyu RNaz içermeyen PEN cam slaytlara dikkatlice monte edin. Pozitif yüklü cam slaytları parmaklarınızla doku yönünde çevirin ve cam slaytı doku bölümüne doğru düzgün bir şekilde bastırın.
   not: Ellerin sıcaklığı, dokunun cama yapışmasına yardımcı olacaktır.
7. Beyin bölümlerini slaytlara monte ettikten sonra, slaytları kriyostat odasının içindeki bir kutuda saklayın ve ardından -80 °C'de saklayın. Slaytları asla oda sıcaklığında tutmayın.
   not: Dokunun katlanması ve yırtılması yaygındır. Doğru posterior analiz için bu artefaktları en aza indirmek önemlidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
PEN Membran Cam Slayt (2 μm)	Yalan	1150518
Araştırma Kriyostatı	Leica Belediyesi	CM3050'ler
RNaseZap RNase Dekontaminasyon Solüsyonu	Balıkçı Bilimsel	AM9780
Tek Kullanımlık Gömme Kalıplarını Soyun	Elektron Mikroskobu Bilimleri	70182
Nokta Atışı Çözüm	Zymo Araştırma	D3001-1
Doku Artı OCT Bileşiği	Balıkçı Bilimsel	23-730-571

Serisi Serisi