$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Dondurularak Saklanmış Beyin Dokusu Kesitlerinin Fiksasyonu ve Boyanması
- RNA bütünlüğünü korumak için, kullanılacak tüm aletleri RNase temizleme solüsyonu ile temizleyin. Çeker ocak içindeki sabitleme ve boyama protokolüne devam edin.
- Tarif edilen fiksatif solüsyonları temiz RNaz içermeyen 50 mL tüplerde hazırlayın. Boyama gününde tüm solüsyonları RNaz içermeyen su ile yapın.
- Lazer mikrodiseksiyonun yapılacağı gün %100, %95, %70 ve %50 etanol solüsyonları hazırlayın. Çözeltileri sıkıca kapalı tüplerde oda sıcaklığında tutun.
- % 75 etanol çözeltisinde% 4 Cresil menekşe ve% 0.5 eozin Y hazırlayın. Solüsyonu 1 dakika kuvvetlice girdaplayın ve çözünmemiş toz izlerini ortadan kaldırmak için 0.45 μm'lik bir naylon filtreden süzün.
- Doku slaytlarını 30 saniye boyunca% 95 etanol içeren bir kaba yerleştirin. Slaytları% 75 etanol içeren tüpe aktarın; Slaytları 30 saniye orada bırakın.
- Slaytları% 50 etanole aktarın ve 25 saniye orada bırakın. Bu noktada, OCT çözülecektir. Slaytı 20 saniye boyunca% 4 Cresil menekşe çözeltisine aktarın ve ardından 5 saniye boyunca% 0.5 eozin Y çözeltisine aktarın.
- Slaytı boya solüsyonundan çıkarın ve slaytı bir filtre kağıdı ile kurulayın. Ardından, slaytları 25 saniye boyunca% 50 etanol içine yerleştirin. Slaytları 25 saniye boyunca% 75 etanole aktarın. Slaytları 30 saniye boyunca% 95 etanole aktarın. Slaytları 60 saniye boyunca% 100 etanole aktarın.
- Slaytı ksilen ile durulayın. Bunları ksilen içeren bir kaba aktarın ve 3 dakika bekleyin.
- Montaj ortamını (örn. Pinpoint sakız) RNaz içermeyen suda hazırlayın. Fare beyin bölümlerini monte etmek için, montaj ortamını RNaz içermeyen suda 1:10 oranında seyreltin.
- Slaytları RNaz içermeyen bir yüzeyde oda sıcaklığında 10 saniye kurutun. Ksilen kurumadan önce, slaytları doku bölümleriyle birleştirmeye devam edin.
- Montaj solüsyonunu steril ve RNaz içermeyen ince bir boya fırçası ile slayt üzerindeki dokunun üzerine nazikçe dağıtın. 10-20 saniye bekleyin ve ardından doku slaytlarını hemen mikroskop mikrodiseksiyon platformuna aktarın.
NOT: Montaj ortamının montaj için kullanılan RNaz içermeyen suya oranı, ilgilenilen dokuya bağlı olarak değişir. Montaj ortamı/su oranı, RNA bütünlüğünü etkilemeden lazer mikrodiseksiyon için glioma doku morfolojisini korur.