$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Beyinden Tek Hücreli Süspansiyon Hazırlığı
- Nihai% 100 bir çözelti elde etmek için yoğunluk gradyan ortamını 15 mL'lik bir konik tüpte PBS ile 9: 1 oranında seyreltin.
- % 1 sodyum pentobarbital (50 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile EAE'nin zirvesinde fareleri anestezik hale getirin ve 20 mL steril buz gibi soğuk PBS ile intrakardiyal olarak perfüze edin. Bunu, 20 mL'lik bir şırınga kullanarak kalbin sol ventrikülüne PBS'yi yavaşça ve istikrarlı bir şekilde enjekte ederek ve sağ atriyumu açarak başarın.
- Kafatasını burundan boynuna kadar dikkatlice kesin, ardından beyni kraniyal kutudan 50 mL konik tüplerde 10 mL RPM'ye çıkarın. Yapışan kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için iyice karıştırın. Daha sonra ortamı aspirasyon ile çıkarın ve 10 mL RPMI ekleyin.
- Beyni ve ortamı 100 mm'lik bir tabağa koyun. Bir tıraş bıçağıyla ince doğrayın.
- Tabaktan 6 mL'yi temiz bir pipetle buz gibi 7 mL sinterlenmiş cam homojenizatöre aktarın. Pipette çok miktarda doku bırakmaktan kaçının. Küçük bir miktar kaçınılmazdır.
- Önce havaneli "gevşek" pistonu kullanarak beyni öğütün, ardından süspansiyon homojen olana kadar "sıkı" pistonu kullanın ve önceden soğutulmuş 15 mL'lik konik bir tüpe dökün ve buz üzerinde tutun.
- Tüm numuneler homojenize edildikten sonra hacmi tahmin edin. RPMI ile ses seviyesini 7 mL'ye ayarlayın. Ardından, soğutulmuş 15 mL'lik konik santrifüj tüpüne 3 mL buz gibi %100 bazal membran matrisi yerleştirin ve son %30'luk bir yoğunluk gradyan ortamı elde etmek için 7 mL beyin homojenatı ekleyin. Birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Girdap yapmayın.
- Keskin bir arayüz sağlamak için, 3 mL'lik bir pipet ile RPMI'de 1 mL %70 altlık yoğunluğu gradyan ortamını dikkatlice ve yavaşça ekleyin.
- 4 °C'de sadece 20 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Hızlanmayı 1'e ve yavaşlamayı 0'a ayarlayın. Santrifüjlemeden sonra, üstteki miyelini tamamen çıkarmaya dikkat ederek üst fazın neredeyse tamamını aspire edin (Şekil 1).
- Arayüzü yeni bir 15 santrifüj tüpüne çıkarın. RPMI ile ses seviyesini 10 mL'ye ayarlayın.
- 10 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı aspire edin. Peletleri ~ 200 μL akış sitometrisi boyama (FSC) tamponunda yeniden süspanse edin.
