Ubikitinillenmiş Peptitlerin İmmünoaffinite Temelli Ekstraksiyonu: Ubikitin Etiketli Peptitleri Saflaştırılmış Peptit Fraksiyonlarından Seçici Olarak Ekstrakte Etmek İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Bezstarosti, K. et al. Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubikitinasyon Bölgelerinin Tespiti. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, karmaşık bir peptit karışımından kalan di-glisin peptitleri içeren ubikitinile peptitlerin ekstrakte edilmesi ve saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Sunulan yöntem, proteindeki orijinal ubikitinasyon bölgelerinin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Protokol

1. Ubikitinile Peptitlerin Ekstraksiyonu

1. Triptik peptitleri fraksiyonlamak için boş bir kolon kartuşuna yüklenmiş polimerik sabit faz malzemesi (300 Å, 50 μM; Malzeme Tablosuna bakınız) ile yüksek pH'lı ters fazlı (RP) C18 kromatografisi kullanın. Sabit faz yatağı boyutu, fraksiyonlanacak protein sindirimi miktarına göre ayarlanmalıdır. ~ 10 mg protein sindirimi için 0,5 g sabit faz materyali ile doldurulmuş boş bir 6 mL sütun kartuşu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın). Protein sindiriminin durağan faz oranına oranı yaklaşık 1:50 (a/a) olmalıdır.
2. Peptitleri hazırlanan kolona yükleyin ve kolonu yaklaşık% 0.1 TFA'lık 10 kolon hacmi ile yıkayın, ardından yaklaşık 10 kolon hacmi H2O ile yıkayın.
3. Peptitleri, sırasıyla% 7,% 13.5 ve% 50 asetonitril (AcN) ile 10 sütun hacmi 10 mM amonyum format çözeltisi (pH = 10) ile üç fraksiyona elute edin. Tüm fraksiyonları eksiksiz hale getirmek için liyofilize edin.
4. DiGly peptitlerinin immünozenginleşmesi için protein A agaroz boncuklarına konjuge edilmiş ubikitin kalıntı motifi (K-ε-GG) antikorları kullanın. Boncuk partisi başına tam antikor miktarı tescilli bilgi olduğundan ve üretici tarafından açıklanmadığından, karışıklığı önlemek için bir boncuk partisi için üreticinin yaptığı gibi aynı tanımın kullanılması önerilir. Bu boncukların bir partisini 2x PBS ile yıkayın ve boncuk bulamacını altı eşit fraksiyona bölün. Ayrıntılı bir deney şeması için Şekil 1'e bakın.
5. 50 mM MOPS, 10 mM sodyum fosfat ve 50 mM NaCl'den (pH = 7.2) oluşan bir tamponun 1.4 mL'lik 1.3. adımında toplanan üç peptit fraksiyonunu çözün ve döküntüyü döndürün.
6. Fraksiyonların süpernatantlarını diGly antikor boncuklarına ekleyin ve bir döndürücü ünite üzerinde 4 ° C'de 2 saat inkübe edin. Boncukları aşağı doğru döndürün ve süpernatanı taze bir antikor boncuk grubuna aktarın ve 4 ° C'de 2 saat tekrar inkübe edin.
7. Süpernatanları sonraki küresel proteom (GP) analizi için saklayın.
8. Boncukları tutmak için boncukları her fraksiyondan GF/F filtre tapası ile donatılmış 200 μL'lik bir pipet ucuna aktarın. Pipet ucunu boncuklarla birlikte bir santrifüj ucu adaptörü ile donatılmış 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne koyun. Boncukları 3 kez 200 μL buz gibi soğuk IAP tamponu ile ve ardından 3 kez 200 μL buz gibi soğuk Milli-Q H₂O ile yıkayın. Her yıkama adımından önce sütunu 2 dakika boyunca 200 x g'da döndürün, ancak sütunun kurumasına izin vermemeye dikkat edin. Peptitleri 2 döngü 50 μL% 0.15 TFA kullanarak elute edin.
9. Peptitleri bir C18 aşama ucu (esasen iki C18 diskli 200 μL'lik bir pipet ucu) kullanarak tuzdan arındırın ve vakumlu santrifüjleme kullanarak eksiksiz hale gelene kadar kurutun.

Sonuçlar

Şekil 1: Deneysel genel bakış.(A) Deneysel yaklaşıma genel bakış. Numuneler hazırlandı, tripsinlendi ve yüksek pH elüsyonlu ters faz kromatografisi kullanılarak üç fraksiyona ayrıldı. Bir grup ticari α-diGly peptit antikor boncuğu altı eşit fraksiyona bölündü ve üç peptit fraksiyonu daha sonra boncuk fraksiyonlarının üçüne yüklendi. DiGly peptitleri immünosaflaştırıldı, ayrıştırıldı ve toplandı ve akış daha sonra kalan üç taze boncuk fra...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Lizil Endopeptidaz (LysC)	Wako Saf Kimyasallar	129-02541
NanoLC fırın	MPI tasarımı, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine sodyum tuzu	Sigma-Aldrich	L-5125
Orbitrap Füzyon Lumos kütle Spektrometre	ThermoFisher (Termo Balıkçı)
PLRP-S (300 Å, 50 μm) polimerik Ters Faz Parçacıkları	Agilent Teknolojileri	PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Kalıntı Motifi (K-ε-GG) Kit	Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri	5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac Kartuş	Sular	WAT036790	tC18 malzemesini Kartuşu doldurmadan önce kartuş PLRP-S ile
Sodyum deoksikolat	Sigma-Aldrich	30970
Tris tabanı	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Tripsin, TPCK Tedavi Edildi	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	20233