DNA Sentezi Testi: Radyoaktif Tritiatlı Timidin İnfüzyonu Kullanılarak Çoğalan Hücrelerde DNA Sentezini Değerlendirme Tekniği

Özet

Kaynak: Williams, M. et al. İnsan Nöral Öncü Hücrelerinde (NPC'ler) Nörogelişimsel Fenotiplerin Hızlı Tespiti. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, hücrelerin DNA'sına radyoaktif izleyici tritiye timidin dahil edilmesini ölçerek nöronal progenitör hücrelerin proliferatif kapasitesini belirliyoruz. Bu teknik, belirli ilaçlar ve büyüme faktörleri ile tedaviden sonra hücre proliferasyonunu incelemek için kullanılabilir.

Protokol

1. NPC'lerin bakımı

1. 1,5 milyon hücre yoğunluğundaki NPC'leri, 2 mL %100 Genleşme Ortamı içeren ECM taklidi jel kaplı bir kuyuya yerleştirin.
2. NPC'leri 37 °C'de %5 CO₂ içeren nemli bir ortamda inkübe edin.
3. Aşırı hücre ölümünü önlemek için P3 veya daha düşük NPC'ler veya çözülmüş NPC'ler için ortama 5 μM ROCK inhibitörü ekleyin. ROCK inhibitörünü çıkarmak için ortamı 24 saat sonra değiştirin.
4. Hücreleri, ne zaman birleştiklerine bağlı olarak her 4-9 günde bir geçiş. Hücreler, çanak yüzeyinin tüm tabanını kaplayan yoğun bir şekilde paketlenmiş tek tabaka haline geldiklerinde birleşmiş olarak kabul edilir.
5. 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğu başına 1 ila 1,5 milyon hücre yoğunluğunda plaka NPC'leri. Kullanılmış ortamı her 48 saatte bir çıkarın ve 2 mL %100 Genişletme Ortamı ile değiştirin.

3. Nöral Öncü Hücre DNA Sentezi Testi

1. 24 oyuklu bir plakada 100.000 hücre / kuyu plakalayın ve üç nüsha / durumda değerlendirin.
2. Kültürde 46 saat sonra her bir oyukta kültür ortamına (1.5 μCi / mL) radyoaktif, tritiye [³H] -timidin ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de 2 h.
   için inkübe edin not: Radyoaktif malzemeleri kullanırken kurumunuzdan eğitim alın, radyoaktivite güvenlik protokollerine uyun ve radyoaktif malzemeleri uygun şekilde belirlenmiş atık kaplarına atın.
3. Her bir oyuğa 300 μL önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin-EDTA (0.5 mM) ekleyin ve 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
4. Hücre hasat makinesini (Malzemeler bölümüne bakın) ve pompayı açın ve pompa basıncının 200 PSI'nin altında olduğundan emin olun. Filtre kağıdını hücre biçerdöverindeki boşluğa yerleştirin ve kağıt yönünü işaretlemek için sağ köşeyi yırtın.
5. Hücre hasat makinesinin toplama tüplerini boş bir "boş" tepsiye yerleştirin ve filtre kağıdını nemlendirmek için ön yıkamaya basın. Toplama tüplerini numune kuyucuklarına yerleştirin ve çalıştırın (başlatın).
6. Hücre hasat makinesi numune toplamayı bitirdiğinde, cl'yi kaldırınamp ve tüm numune setleri için tekrarlamak üzere filtre kağıdını ilerletin. Daima boş, "boş" bir tabakta ön yıkama yapın.
7. Filtre kağıdını bir ışık kaynağı altında kurutun ve ilgili şişeleri bir tepsiye yerleştirin. Kağıt çarşafları şişelere delinin ve her şişeye 2 mL sıvı sintilasyon kokteyli ekleyin. Kapak ve etiket şişeleri.
8. Bir sintilasyon makinesinde dakika başına sayıları (CPM'ler) okumadan önce şişeleri en az 1 saat sıvı bir sintilasyon kokteyli içinde inkübe edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Gelişmiş DMEM/F12 Orta	ThermoFischer Bilimsel	12634-010	%100 Genleşme Ortamı Bileşeni
Nörobazal Orta	ThermoFischer Bilimsel	21103049
24 oyuklu plakalar	ThermoFischer Bilimsel	2021-05	Polistiren plakalar: NPC DNA Sentezi Testi için kullanılır
Doğal Fare Laminin	Canlandırıcı	23017-015	Kaplama plakaları için substrat: NPC DNA Sentezi, S-Fazı Girişi ve Hücre Sayısı Tahlilleri için kullanılır
Penisilin / Streptomisin	ThermoFischer Bilimsel	15140122	Antibiyotik, Genleşme Ortamındaki bileşen
% 2.5 Tripsin (10X)	Gibco (Gibco)	15090-046	10X enzimatik çözelti
0,5 M EDTA	ThermoFischer Bilimsel	AM9261	DNA Sentez Testi için hücreleri kaldırmak için tripsin çözeltisinde kullanılır
tritiye [3H]-timidin	PerkinElmer	NET027E001	Radyoaktif trityum, timidin
Fisherbrand 7 mL HDPE Sintilasyon Şişeleri	Balıkçı markası	03-337-1	Sıvı sintilasyon sayımı için şişeler
EcoLite(+)	MP Biyomedikal	188247501	Sıvı sintilasyon kokteyli
LS 6500 çok amaçlı sıvı sintilasyon sayacı	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	8043-30-1194	Sıvı Sintilasyon Sayacı
Skatron Yarı Otomatik Hücre Hasat Makinesi	Moleküler Cihazlar ve Skatron Instruments, Inc.	11019 yazın	Yarı otomatik hücre hasat makinesi
Sınıf GF / C filtre kağıdı, Whatman	GE Sağlık Yaşam Bilimleri	1822-849	Cam elyaf filtre kağıdı

Serisi