DNA Sentezi Testi: Radyoaktif Tritiatlı Timidin İnfüzyonu Kullanılarak Çoğalan Hücrelerde DNA Sentezini Değerlendirme Tekniği

Özet

Kaynak: Williams, M. et al. İnsan Nöral Öncü Hücrelerinde (NPC'ler) Nörogelişimsel Fenotiplerin Hızlı Tespiti. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, hücrelerin DNA'sına radyoaktif izleyici tritiye timidin dahil edilmesini ölçerek nöronal progenitör hücrelerin proliferatif kapasitesini belirliyoruz. Bu teknik, belirli ilaçlar ve büyüme faktörleri ile tedaviden sonra hücre proliferasyonunu incelemek için kullanılabilir.

Protokol

1. NPC'lerin bakımı

1. 1,5 milyon hücre yoğunluğundaki NPC'leri, 2 mL %100 Genleşme Ortamı içeren ECM taklidi jel kaplı bir kuyuya yerleştirin.
2. NPC'leri 37 °C'de %5 CO₂ içeren nemli bir ortamda inkübe edin.
3. Aşırı hücre ölümünü önlemek için P3 veya daha düşük NPC'ler veya çözülmüş NPC'ler için ortama 5 μM ROCK inhibitörü ekleyin. ROCK inhibitörünü çıkarmak için ortamı 24 saat sonra değiştirin.
4. Hücreleri, ne zaman birleştiklerine bağlı olarak her 4-9 günde bir geçiş. Hücreler, çanak yüzeyinin tüm tabanını kaplayan yoğun bir şekilde paketlenmiş tek tabaka haline geldiklerinde birleşmiş olarak kabul edilir....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Gelişmiş DMEM/F12 Orta	ThermoFischer Bilimsel	12634-010	%100 Genleşme Ortamı Bileşeni
Nörobazal Orta	ThermoFischer Bilimsel	21103049
24 oyuklu plakalar	ThermoFischer Bilimsel	2021-05	Polistiren plakalar: NPC DNA Sentezi Testi için kullanılır
Doğal Fare Laminin	Canlandırıcı	23017-015	Kaplama plakaları için substrat: NPC DNA Sentezi, S-Fazı Girişi ve Hücre Sayısı Tahlilleri için kullanılır
Penisilin / Streptomisin	ThermoFischer Bilimsel	15140122	Antibiyotik, Genleşme Ortamındaki bileşen
% 2.5 Tripsin (10X)	Gibco (Gibco)	15090-046	10X enzimatik çözelti
0,5 M EDTA	ThermoFischer Bilimsel	AM9261	DNA Sentez Testi için hücreleri kaldırmak için tripsin çözeltisinde kullanılır
tritiye [3H]-timidin	PerkinElmer	NET027E001	Radyoaktif trityum, timidin
Fisherbrand 7 mL HDPE Sintilasyon Şişeleri	Balıkçı markası	03-337-1	Sıvı sintilasyon sayımı için şişeler
EcoLite(+)	MP Biyomedikal	188247501	Sıvı sintilasyon kokteyli
LS 6500 çok amaçlı sıvı sintilasyon sayacı	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	8043-30-1194	Sıvı Sintilasyon Sayacı
Skatron Yarı Otomatik Hücre Hasat Makinesi	Moleküler Cihazlar ve Skatron Instruments, Inc.	11019 yazın	Yarı otomatik hücre hasat makinesi
Sınıf GF / C filtre kağıdı, Whatman	GE Sağlık Yaşam Bilimleri	1822-849	Cam elyaf filtre kağıdı

Serisi