NPC Nörosfer Testi: Nörosferden Nöral Öncü Hücrelerin Göç Tepkisini Değerlendirmek İçin Bir İn Vitro Test

Bu makalede

Özet

Kaynak: Williams, M. et al. İnsan Nöral Öncü Hücrelerinde (NPC'ler) Nörogelişimsel Fenotiplerin Hızlı Tespiti.J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, mikroskobik analiz yoluyla nöral öncü hücre nörosfer göç testini (nörosferden nöral öncü hücrelerin göç tepkisini incelemek için bir in vitro test) göstermektedir.

Protokol

1. NPC Nörosfer Göç Testi

Nörosfer Oluşumu
1. 1 mL %100 Genleşme Ortamını, kaplama alt tabakası olmayan 35 mm'lik bir tabağa ekleyin. NPC'leri kaplamadan önce bulaşıkları 37 °C'de en az 15 dakika kuluçkaya yatırın. Hücre göçü testi için yeterli nöroküre olacağından emin olmak için 2-3 tabak hazırlayın.
  not: Bir kaplama substratının olmaması, NPC'lerin ortamda asılı kalmasını sağlar, bu da nörosfer oluşumu için gereklidir. Kaplama kapları nörosfer oluşumunu önleyecektir.
2. Hücreleri kaldırın, ayrıştırın, ve pelet hücreleri. Hücre peletini 2-5 mL önceden ısıtılmış %100 Genleşme Ortamında yeniden süspanse edin. Bölüm 1.1.1'de hazırlanan her 35 mm'lik çanağa 1 milyon NPC koyun.
3. NPC'lerin toplanmasına ve nöroküreler oluşturmasına izin vermek için NPC'leri 37 °C'de 48 ila 96 saat kuluçkaya yatırın. Faz kontrast mikroskobunda canlı bir cetvel kullanarak küre boyutunu değerlendirin. Çoğu kürenin yaklaşık 100 μm (± 20 μm) çapa ulaşmasını bekleyin (Şekil 1). Daha küçük küreler, göç tahlili sırasında tamamen dağılacak ve parçalanacaktır.
Nörosfer Migrasyon Testi için Plakaların Hazırlanması
1. ECM taklidi jel alikotlarını 6 mL %30 Genleşme Ortamında çözün. ECM mimik jel/%30 Genleşme Ortamı çözeltisi hazırlandıktan sonra, istenen konsantrasyonlarda araçları, büyüme faktörlerini veya ilgilenilen ilaçları ekleyin.
  not: Araç, ilaç ve büyüme faktörü konsantrasyonlarının, bölüm 1.3'te 200 μL nöroküre ilavesini hesaba katacak şekilde arttırılması gerekmektedir.
2. ECM mimik jel /% 30 Genleşme Ortamı çözeltisinin (± araçlar, büyüme faktörleri veya ilaçlar) 1 mL plakasını 6 oyuklu bir plakanın bir kuyusuna yerleştirin. Deney koşulu başına 2-3 kuyu yapın. Alternatif olarak, 35 mm'lik tabaklar kullanılabilir. Plakaları 37 ° C'de en az 30 dakika inkübe edin^.
  not: Bu test için ECM mimik jel/%30 Genleşme Ortamı solüsyonunu ASPİRE ETMEYİN. Kürelerin aspire edilmiş bir ECM-Mimic jel üzerine kaplanması, hızlı ve aşırı migrasyona yol açacaktır.
Kaplama Nöroküreleri
1. Bölüm 1.1'de oluşan nöroküreleri toplayın ve bunları konik bir tüpe yerleştirin. Tüm nörosferlerin toplandığından emin olmak için 35 mm'lik bulaşıkları 1 mL 1x PBS ile yıkayın. Toplanan nöroküreleri 5 dakika boyunca 100 x g'da döndürün.
2. Nörosferleri 1-3 mL önceden ısıtılmış %30 Genleşme Ortamında yeniden süspanse edin. 1 tabak nöroküre toplanırsa, küreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL ortam kullanılır. 2 tabak toplanırsa, küreleri yeniden süspanse etmek için 2 mL ortam eklenir, vb. Nazikçe pipetleyin ve kürelerin kırılmadığından emin olmak için yalnızca bir P-1000 kullanın.
3. Bölüm 1.2'de yapılan ECM-mimik jel/%30 Genleşme çözeltisine yeniden süspanse edilmiş nörokürelerin 200 μL'sini plakalayın. Nörosferleri eşit olarak dağıtmak için her yöne kaya plakaları. Plakaları 37 ° C'de 48 saat inkübe edin.
4. ECM taklit jel/%30 Genleşme Ortamı solüsyonunu çıkarın ve hücreleri %4 PFA'da sabitleyin, yıkayın ve hücreleri 1x PBS + %0.05 Sodyum Azid'de tutun.
Nörosferlerin Analizi
1. 10X'te faz kontrast ayarlarını kullanarak tüm nörosferlerin görüntülerini elde edin. Kürelerin birbirine değmediğinden emin olun. ImageJ yazılımını kullanarak ortalama geçişi ölçün.
2. Serbest çizgi aracını kullanarak nörosferin dış konturunu izleyin. Serbest çizgiye, "düz" çizgi simgesine sağ tıklanarak erişilebilir. Fare kullanarak manuel olarak izleyin.
3. İzlemenin alanını hesaplamak için hesaplama işlevini kullanın. Analiz sekmesi altında bulunan "Ölçümleri Ayarla" penceresinde okuma olarak "alan"ın seçildiğinden emin olun. Mavi dış kontur izi için Şekil 2'ye bakın.
4. Kürenin iç hücre kütlesini izleyin ve alanı ölçün. Kırmızı iç kontur izi için Şekil 2'ye bakın. İç hücre kütlesini toplam nörosfer alanından çıkararak ortalama göçü ölçün.
5. Hücrelerin bitişik bir halı olarak göç ettiği yoğun bir şekilde paketlenmiş bir iç hücre kütlesi sergileyen nörosferleri ölçün (Şekil 2).
6. Ölçüm için halının dışına veya nörosferden ayrılmış hücreleri dahil etmeyin. Dış halı ölçümünün dışında bırakılan hücre örnekleri (beyaz daire içine alınmış) için Şekil 2'ye bakın. Her koşul için en az 20 nöroküreyi analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

figure-results-1
Şekil 1: Migrasyon tahlili için nörosferlerin seçilmesi. (A) 24 saatte temsili bir nörosfer alanının faz kontrast görüntüsü. Kürelerin tümü 100 μm'den azdır ve bu nedenle migrasyon testi için toplanmaz. (B) 72 saatte temsili bir nörosfer alanının faz kontrast görüntüsü. Tüm küreler 100 μm ± 20 μm aralığındadır, bu da migrasyon testi için toplanmaya hazır olduklarını gösterir.