Astrosit İzolasyonu: Fare Kortikal Astrositlerinin Saf Preparatını Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Schildge, S. et al. Fare Kortikal Astrositlerinin İzolasyonu ve Kültürü. J. Vis. Uzm. (2013)

Bu videoda, yeni doğmuş farelerden saf bir astrosit preparatı elde etme yöntemini açıklıyoruz.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Karışık Kortikal Hücrelerin İzolasyonu ve Kaplanması

Astrosit kültürleri için karışık kortikal hücre izolasyonu, P1 ila P4 fare yavruları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Uygun astrosit yoğunluğunu elde etmek için, T75 doku kültürü şişesi başına 4 fare yavrusu korteksi kullanmak gerekir. Bu nedenle, aşağıdaki protokoldeki hacimler, 4 fare yavrusu kullanılarak bir hücre hazırlığı için hesaplanmıştır.

1. Diseksiyon prosedürüne başlamadan önce, 30 mL astrosit kültür ortamını (DMEM, yüksek glikoz +% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu +% 1 Penisilin / Streptomisin; tabloya bakınız) 37 ° C'ye ısıtın. Bir T75 şişesini, CO₂ inkübatöründe 37 ° C'de 1 saat boyunca hücre kültürü dereceli suda 50 μg / mL konsantrasyonda 20 mL poli-D-lizin (PDL) ile kaplayın.
2. Diseksiyon prosedürü için gerekli tüm reaktifleri ve malzemeleri hazırlayın. Cerrahi makas, pürüzsüz ince forseps, düz uçlu forseps, kağıt havlu, atık torbası, %70 etanol ve her biri 2 mL HBSS ile doldurulmuş buz üzerinde 3,5 diseksiyon kabına (2 cm çapında) ihtiyacınız olacak.
3. Fare yavrusunun başını ve boynunu nazikçe tutun ve %70 etanol ile püskürtün. Hayvan makas kullanılarak başı kesilerek kurban edilir.
4. Kafatasını ortaya çıkarmak için kafa derisi boyunca arkadan öne doğru bir orta hat kesisi yapın.
5. Kafatasını boynundan burnuna kadar dikkatlice kesin. Beyne daha fazla erişim sağlamak için iki ek kesim yapılır: İlk kesi, koku alma ampullerinin önüne, diğeri ise kafatasını kafatası tabanından ayırmak için beyincikten daha aşağıya yapılır.
6. Düz uçlu forsepsler kullanılarak, kraniyal flepler nazikçe yana çevrilir ve beyin çıkarılır ve HBSS ile doldurulmuş ilk diseksiyon kabına yerleştirilir. Çanağı tekrar buzun üzerine koyun ve 4 beyni de toplamaya devam edin.
7. Diseksiyon prosedürünün geri kalanı stereomikroskop altında gerçekleştirilir. İlk olarak, koku soğancıkları ve beyincik, ince diseksiyon forsepsleri kullanılarak çıkarılır (Şekil 1B).
8. Korteksleri geri almak için, ince forsepslerle beynin arka ucunu tutun, hemisferler arasında orta hat kesisi yapın, oluşturulan koruya ikinci bir forseps seti yerleştirin ve korteksin plaka benzeri yapısını beyinden soyun.
9. İnce forseps ile çekerek meninksleri korteks hemisferlerinden dikkatlice inceleyin (Şekil 1D'). Bu adım, son astrosit kültürünün meningeal hücreler ve fibroblastlar tarafından kontaminasyonunu önler. Hazırlanan korteks yarım kürelerini HBSS ile doldurulmuş ikinci tabağa aktarın ve tekrar buzun üzerine koyun. 4 korteksin tümü ile buna göre devam edin.
10. Son olarak, her korteks yarım küresini keskin bıçaklar kullanarak (yaklaşık 4 ila 8 kez) küçük parçalara ayırın.
11. Steril koşullar altında, korteks parçalarını 50 mL'lik bir Falcon tüpüne aktarın ve toplam 22.5 mL hacme HBSS ekleyin.
12. 2,5 mL %2,5 tripsin ekleyin, karıştırın ve dokuyu 37 ° C'de su banyosunda 30 dakika inkübe edin. Her 10 dakikada bir ara sıra çalkalayarak karıştırın.
13. Korteks doku parçalarını peletlemek için 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
14. Süpernatanı dekantasyon ile dikkatlice çıkarın. Doku peletini kaybetmemek için, bir pipet kullanarak mekanik olarak tutabilirsiniz. Doku parçaları tek hücrelere ayrılana kadar (20 ila 30 kez) 10 mL plastik pipet kullanarak 10 mL astrosit kaplama ortamı ve kuvvetli pipetleme ekleyerek dokuyu tek hücreli bir süspansiyona ayırın. Astrosit kaplama ortamı kullanarak hacmi 20 mL'ye ayarlayın. Bir hematositometre kullanarak sayarak korteks dokusunun tek hücrelere ayrışmasını kanıtlayabilirsiniz. 4 fare yavrusu korteksinden oluşan bir preparasyon, 10-15 x10⁶ ayrışmış tek hücre vermelidir.
15. T75 kültür şişesinden PDL'yi aspire edin, ayrışmış tek hücreli süspansiyonu kaplayın ve CO₂ inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.

2. Zenginleştirilmiş Bir Astrosit Kültürü Elde Etmek

1. Karışık kortikal hücrelerin kaplanmasından 2 gün sonra ve daha sonra 3 gün boyunca ortamı değiştirin.
2. 7 ila 8 gün sonra, astrositler birleştiğinde ve mikroglialar astrosit tabakasına maruz kaldığında veya astrosit tabakasından zaten ayrıldığında (Şekil 2), mikroglia'yı çıkarmak için T75 şişesini 180 rpm'de 30 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Mikroglia içeren süpernatanı atın veya mikroglia'yı kültürlemek ve incelemek istiyorsanız, aşağı doğru döndürün ve kültür için plakalayın.
3. 20 mL taze astrosit kültür ortamı ekleyin ve oligodendrosit öncü hücrelerini (OPC) çıkarmak için şişeyi 240 rpm'de 6 saat çalkalayarak devam edin. Bazı OPC'ler astrosit tabakasından tamamen ayrılmayacağı için OPC kontaminasyonunu önlemek için 1 dakika boyunca elle kuvvetlice çalkalamaya devam edin. OPC'leri kültürlemek istiyorsanız, süpernatanı atın veya aşağı doğru döndürün ve plakalayın.
4. Kalan birleşik astrosit tabakasını PBS ile iki kez durulayın, PBS'yi aspire edin, 5 mL tripsin-EDTA ekleyin ve CO₂ inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin. Her 5 dakikada bir astrositlerin ayrılmasını kontrol edin ve şişeyi avucunuzun içine vurarak (2-3 kez) astrositlerin ayrılmasını sağlayın.
5. Astrositler kültür şişesinden ayrıldıktan sonra, 5 mL astrosit kültür ortamı ekleyin, hücreleri 5 dakika boyunca 180 x g'da döndürün, süpernatanı aspire edin ve 40 mL taze astrosit kaplama ortamı ekleyin. Bir T75 doku kültürü şişesi, ilk hücre bölünmesinden sonra yaklaşık 1x10⁶ hücre vermelidir. Hücreleri iki T75 kültür şişesinde plakalayın ve CO₂ inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin. Ortamı her 2 ila 3 günde bir değiştirin.
6. İlk bölünmeden 12-14 gün sonra, astrositler deneyi gerçekleştirmeden 24-48 saat önce uygun hücre konsantrasyonunda kaplanır. Bir T75 doku kültürü şişesi, ikinci hücre bölünmesinden sonra yaklaşık 1.5-2 x10⁶ hücre vermelidir.

Sonuçlar

Şekil 1. Doğum sonrası (P3) fare korteksinin diseksiyonu. A) Tüm beyin. B) Koku soğancıklarının ve beyinciğin çıkarılmasından sonra beyin. C) Beyindeki korteksin plakaya benzer yapısının soyularak kortekslerin izolasyonu. D, D') Meninksli ventral ve dorsal bölgeden korteks (siyah oklar meningeal arterleri gösterir). E) Meninkssiz korteks. Ölçek çubuğu, 1,5 mm.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Astrosit kültür ortamı
DMEM yüksek glikoz	Yaşam Teknolojileri	31966-021
FBS ısıyla etkisiz hale getirilir	Yaşam Teknolojileri	10082-147	Nihai Konsantrasyon: %10
Penisilin-Streptomisin	Yaşam Teknolojileri	15140-122	Nihai Konsantrasyon: %1
Beyin dokusu sindirimi için çözüm
HBSS (Türkçe)	Yaşam Teknolojileri	14170-088
% 2.5 Tripsin	Yaşam Teknolojileri	15090-046	Nihai Konsantrasyon: %0,25
Diğer
%70 (hacim/hacim) etanol	Roth	9065.2
Poli-D-Lizin	Millipor A-003	A-003-E
Su	PAA (Türkçe)	S15-012 Serisi	Hücre kültürü sınıfı
Pbs	PAA (Türkçe)	H15-002	Hücre kültürü sınıfı
% 0.05 Tripsin-EDTA	Yaşam Teknolojileri	25300-062
0.45 μm Steril filtre	Sartorius	16555
3,5 cm petri kabı	BD Şahin	353001
15 ml Falcon tüpü	BD Şahin	352096
50 ml Şahin tüpü	BD Şahin	352070
75 cm2 Doku kültürü şişesi	BD Şahin	353136
Forseps iyi	Dumont	2-1032; 2-1033	#3c; #5
Forseps düz uç	KLS kırlangıç	12-120-11
13 cm cerrahi makas	Aesculap Belediyesi	M.Ö. 140-R
Stereomikroskop	Leica Belediyesi		MZ7.5
Stereomikroskop + Kamera	Leica Belediyesi		MZ16F; DFC320
Mikroskop + Kamera	Zeiss; Canon		Primo Vert; PowerShot A650 IS
merkezkaç	Eppendorf Belediyesi	5805000.017	Santrifüj5804R
Yörünge Çalkalayıcı	Termo Bilimsel	SHKE 4450-1CE	Maksimum Q 4450
Su banyosu	Julabo Belediyesi		SW20; 37 °C

(İngilizce) Serisi Serisi Serisi Serisi fotoğraf makinesi