Sıçan Beyin Mikrodamarlarından Endotel Hücre Kültürü: Sıçan Beyninin Mikro Damarlarından Endotel Hücrelerini İzole Etme ve Kültür Prosedürü

Özet

Kaynak: Molino, Y. et al. Sıçan Kan-Beyin Bariyerinin (BBB) İn Vitro Modelinin Kurulması: BBB Geçirimsizliği ve Reseptör Aracılı Taşımaya Odaklanma. J. Vis. Uzm.(2014)

Bu video, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ve enzimatik sindirim yöntemlerinin bir kombinasyonunu kullanarak bir sıçan beyninden mikro damarların izolasyonunu sunar. İzole edilen mikro damarlar, endotel hücre kolonileri elde etmek için kollajen ve fibronektin matrisi ile önceden kaplanmış bir kültür şişesinde kültürlenebilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Sıçan Beyin Mikrodamarlarının İzolasyonu

1. Her hazırlık için ve bir deneyci için, 3 adet beş haftalık Wistar faresi kullanın.
2. İlk haftanın Pazartesi günü, her ikisi de 1 μg /^cm2'de steril kültür suyunda (T75 başına 10 ml) kollajen tip IV ve fibronektin ile kaplayarak 2 T75 şişesi hazırlayın. Mikro damar tohumlanana kadar 37 ° C'de yapışmasına izin verin.
3. İlk haftanın Çarşamba sabahı, uyuşukluk, duruş kaybı ve solunum kesintisine neden olmak için fareleri artan bir CO₂ akışı altında ötenazi yapın, ardından servikal çıkık izleyin. Kafalara% 70 etanol püskürtün. Kafaları bir makasla kesin ve laminer akış başlığı altında kuru bir Petri kabına aktarın.
4. Beyinleri beyincik ve optik sinirler olmadan kafatasından çıkarın, daha sonra buz üzerinde soğutulmuş ve soğuk diseksiyon tamponu ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın (HBSS% 1 BSA, penisilin 100 birim / ml ve streptomisin 100 μg / ml ile desteklenmiştir).
5. 2 serebral hemisferi ayırmak ve orta beyni ön beyinden ayırmak için beyinleri ikiye bölün. Ön beyinleri diseksiyon tamponu ile buz üzerinde temiz bir Petri kabına aktarın.
6. N° 5 kavisli forsepsli bir stereomikroskop altında ön beyinlerden meninksleri dikkatlice çıkarmak için soğuk diseksiyon tamponlu yeni bir Petri kabında birkaç yarım küre alın. Ardından, miyelin yorganını çıkarmak ve bir korteks kabuğu elde etmek için beynin içini temizleyin. Doku koruması ve hücre sağkalımı için bu adımlar 2 saatten fazla sürmemelidir.
7. Korteksi 3 beyinden 6 mL soğuk diseksiyon tamponuna 7 mL dounce homojenizatörde 7 mL dounce homojenizatörde 10 yukarı ve aşağı vuruşla 2 farklı açıklığa sahip 2 havaneli ile 71 μm ve ardından 20 μm ayırın.
8. 50 mL'lik bir Falcon tüpünün 1 mL'sinde 1 korteks eşdeğerini elde etmek için süspansiyonu bölün ve RT'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin.
9. Süspansiyonu 1 korteksten 1 mL kollajenaz / dispas (60 μg / mL – 0.3 U / mL), DNaz tip I (35 μg / mL – 20 K birim / mL) ve gentamisin (50 μg / mL) karışımı içeren bir enzimatik çözelti ile 37 ° C'de 30 dakika boyunca bir çalkalayıcıda sindirin.
10. 1 korteksten alınan 1 mL digest'i 10 mL %25 BSA/HBSS 1X ile karıştırın ve RT'de 15 dakika boyunca 3.600 x g'da yoğunluğa bağlı santrifüjleme ile ayırın. Üst diski (miyelin ve beyin parankimi) ve süpernatanı dikkatlice 50 mL'lik temiz bir Falcon tüpüne aktarın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Elde edilen peleti beyin mikrodamarlarını içeren 4 °C'de tutun.
11. Üst diski ve süpernatanı dikkatlice atın. Beyin mikrodamarlarını içeren her iki peleti 1 mL soğuk HBSS 1X ile yeniden süspanse edin ve temiz bir 50 mL Falcon tüpüne aktarın.
12. Mikrodamarları 20 mL soğuk HBSS 1X ekleyerek yıkayın ve 1.000 x g'da 5 dakika
santrifüjleyin.
13. Ayrıca, bir çalkalayıcıda 37 ° C'de 1 saat boyunca adım 1.9'da tarif edildiği gibi 1 mL aynı enzimatik çözelti ile 1 korteksten mikro damarları sindirin.
14. Daha sonra, 3 korteksin her birinden sindirilmiş mikro damarları bir tüpe karıştırın ve ayrıca tüp başına bir buçuk (1.5) korteks eşdeğerinden ekstrakte edilen mikro damarları elde etmek için iki adet 50 mL Falcon tüpüne ayırın. 30 mL soğuk diseksiyon tamponu ekleyin ve RT'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin.
15. % 20 sığır trombositinden fakir plazma türevi serum, bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 2 ng / mL), heparin (100 μg / mL), gentamisin (50 μg / mL) ve HEPES (2.5 mM) ile desteklenmiş 10 mL DMEM / F12 içinde mikrodamar peletini yeniden süspanse edin, 4 μg / mL'de puromisin ile desteklenmiş endotel hücre ortamı (ECM) olarak adlandırılır.
16. 2 kaplamalı T75 şişesini inkübatörden alın, kaplamanın fazlalığını aspire edin ve her tüpten mikro damarları bir T75 şişesine yerleştirin (T75 şişesi başına 1.5 korteksten çıkarılan mikro kaplar).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fetal sığır serumu	Canlandırıcı	10270-098	-20 °C / 1 yıl
BSA fraksiyonu V düşük endotoksin	PAA (Türkçe)	K45-011-500g	4 °C
Penisilin-streptomisin	Canlandırıcı	15140-122	-20 °C
T75 şişeleri	Becton Dickinson Şahin	353135
HEPES tamponu (1 M)	Canlandırıcı	15630-056	4 °C / 1 yıl
Kollajen tip IV fare (10 x 1 mg)	Becton Dickinson'ın fotoğrafı.	356233	-20 °C / 1 ay
Fibronektin humain plazma (5 mg)	Becton Dickinson'ın fotoğrafı.	356008	-20 °C / 1 ay
Vannas yaylı makas, düz (9 cm)	Güzel Bilim Araçları	91500-09
Makas, düz (9 cm)	Güzel Bilim Araçları	14568-09
Forseps Dumont #5/45 (11 cm)	Güzel Bilim Araçları	11251-35
Graefe Forseps, uç genişliği 0,8 mm	Güzel Bilim Araçları	11050-10
Graefe Forseps, eğri uç genişliği 0,8 mm	Güzel Bilim Araçları	11051-10
Kollajenazlar / dispas karışımı (2 x 5 mg)	Roche Diagnostik	05 401 054 001	-20 °C / 3 ay
DNaz I (100 mg / 569 KU / mg)	Sigma Aldrich	DN25-100 mg	-20 °C / 1 yıl
Gentamisin (10 mg / ml)	Canlandırıcı	15710-049	4 °C / 1 yıl
DMEM/F12	Canlandırıcı	31331-028	4 °C
Trombositten fakir plazmadan sığır serumu (500 ml)	Klinik Bilimleri	BT-214-100	-20 °C / 1 yıl
bFGF (10 μg)	Canlandırıcı	13256-029	-20 °C / 6 ay
Domuz mukozasından Heparin Na tuzu Derece I	Sigma Aldrich	H3149-100KU	4 °C / 1 yıl
Puromisin	Sigma Aldrich	P8833-10 mg	-20 °C / 6 ay

· Serisi Serisi · ·