Kan-beyin tümör bariyeri veya BBTB modeli: Terapötiklerin tümöre verilmesini değerlendirmek için kan-beyin bariyeri veya BBB modelinin bir uyarlaması

Özet

Kaynak: Le Joncour, V. et al. Bir Tabakta Kan-beyin Tümör bariyeri kullanarak In Vivo Yüklerin Teslimatını Tahmin Etme. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, kan-beyin tümörü bariyerini taklit eden bir in vitro model oluşturmak için kapsamlı bir protokol açıklıyoruz. Model, beyin tümörlerinin tedavisi için terapötik ajanların verilmesini anlama sözü veriyor.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. BBTB Mimiklerinin Kurulması

NOT: Hücre kültürü ortamı ve takviyeleri Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

1. Astrositlerin Hazırlanması
   not: Aşağıdaki hacimler 10 cm'lik bir Petri kabı veya bir T75 hücre kültürü şişesi için uygundur.
   1. Steril bir hücre kültürü başlığı altında, kültürlenmiş astrositleri 5 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile dikkatlice yıkayın. PBS'yi bir vakum pompası kullanarak nazikçe atın ve hücreleri ayırmak için 5 dakika boyunca (37 ° C'de, Malzeme Tablosuna bakın) 2 mL hücre ayrışma reaktifi ekleyin. Mikroskop altında hücre ayrılmasını kontrol edin. Hücreler üzerindeki stresi sınırlamak için 5 dakikalık inkübasyon süresini aşmayın.
   2. Hücre ayrışma reaktifinin aktivitesini inhibe etmek için kaba 10 mL steril tam astrosit hücre kültürü ortamı (ABM +) ekleyin. Ayrılan hücreleri kaptan steril 15 mL'lik bir tüpe aktarmak için steril bir serolojik pipet kullanın. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında (RT) 250 rcf'de (hızlanma: 9 rcf/s, yavaşlama: 5 rcf/s) 3 dakika santrifüjleyin.
   3. Bu arada, ekleri hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın): Steril forseps kullanarak, ekleri beyin tarafı yukarı bakacak şekilde (Şekil 1A) steril 6 oyuklu bir plakanın kapağına yerleştirin (Şekil 1B). İşlem sırasında kesici uçlara dokunmadan veya hareket ettirmeden plakanın kesici uçlara baş aşağı yerleştirilebildiğini önceden doğrulayın.
      NOT: Eklerin uygun şekilde yerleştirilmesi, astrosit süspansiyonunun zar ile kuyu tabanı arasında sıkışmasına izin verir.
   4. Santrifüjlendikten sonra, süpernatanı hücre süspansiyonundan dikkatlice atın; peleti tüpün duvarında 5x'e kadar nazikçe yeniden süspanse ederek astrosit peletini 1 mL ABM + içinde yeniden süspanse edin. Hücreler üzerindeki stresi sınırlamak için hücrelerin aşırı pipetlenmesini önleyin. Hücreleri sayın ve hücre süspansiyon yoğunluğunu 400 μL ABM +/insert içinde 1,5 x 10⁵ hücre olarak ayarlayın.
   5. Hücre süspansiyonunu, ek parçanın zarının beyin tarafının ortasına yerleştirin (Şekil 1B) ve çok dikkatli bir şekilde, steril bir pipet ucu ile kılcal kuvvet kullanarak yayın. Membran özellikle kırılgan olduğu için doğrudan temastan kaçının.
   6. Eklerin beyin tarafı hala yukarıdayken, 6 oyuklu plakayı eklerin üzerine geri yerleştirin. Bu, hücre süspansiyonunun zar ile kuyunun gerçek tabanı arasında sıkışıp kalmasını sağlar (Şekil 1C). Astrositlerin zar üzerinde homojen bir şekilde yayılmasını önleyeceği için hücre süspansiyonundaki hava kabarcıklarından kaçının.
   7. Hücrenin en az 2 saat (murin ölümsüzleştirilmiş astrositler) ve 6 saate kadar (insan birincil astrositleri) yapışmasını sağlamak için plakayı ve ekleri beyin tarafı yukarı bakacak şekilde inkübatöre (% 5 CO₂ ile 37 ° C'de) yerleştirin.
      NOT: Ekler baş aşağı tutulduğundan, hücre yapışmasının mikroskop altında görüntülenmesi mümkün değildir. Bu nedenle, ayrı bir düzenli hücre kültürü kabının tohumlanması ve zaman içinde kaptaki hücre yapışmasının kontrol edilmesi önerilir. Membranlar hasar gördüğünde sonuçlar güvenilmez olacağından, membranın dikkatli bir şekilde manipüle edilmesi bir zorunluluktur.
   8. Kuluçka süresinin sonunda, tohumlama alanı dışında hücre süspansiyonu sızıntısı olmadığını doğrulayın ve sızıntı yapıyorsa ekleri atın. 6 oyuklu plakayı, şimdi kan tarafı yukarı bakacak eklerle normal konumuna geri getirin (Şekil 1A). Her kuyucuğa 2.6 mL ABM+ ekleyin. Her bir parçaya 2,5 mL tam astrosit ortamı dökün ve plakayı inkübatöre yerleştirin (% 5 CO₂ ile 37 ° C'de).

2. Endotel Hücrelerinin Hazırlanması

NOT: Murin beyin mikrovasküler endotel hücreleri (bEND3) için, deney gününde optimal sıkı bağlantı protein ekspresyonunu tetikleyen maksimum hücre-hücre temasını sağlamak için hücrelerin %100 birleşmeye ulaşması gerekir. Bu, insan göbek damarı endotel hücreleri (HuAR2T) için geçerli değildir, çünkü bu hücreler için sıkı bir bağlantı protein ekspresyonu için astrositlerin varlığı gereklidir.

1. Hücre ayrışması için astrositler için daha önce tarif edildiği gibi devam edin. Santrifüjlendikten sonra, süpernatanı dikkatlice atın; hücre süspansiyonunu tüpün duvarına 5 kata kadar yavaşça pipetleyerek 1 mL tam endotel hücre kültürü ortamında (EBM +) endotel hücre peletini yeniden süspanse edin. Hücreler üzerindeki stresi sınırlamak için hücrelerin aşırı pipetlenmesini önleyin. Hücreleri sayın ve hücre süspansiyon yoğunluğunu, serum (EBM-) ve vasküler endotelyal büyüme faktörü-A (VEGF-A) içermeyen 2.5 mL / endotel hücre kültürü ortamında 2 x 10⁵ hücreye ayarlayın.
2. Ekleri içeren plakayı çıkarın, ortamı kan tarafından dikkatlice atın ve 2.5 mL endotel hücre süspansiyonu ile değiştirin. Plakayı inkübatöre geri koyun (% 5 CO₂ ile 37 ° C'de) ve endotel hücrelerinin zara yapışması için gece boyunca bırakın.
3. Ertesi gün, her bir oyuğa 3 mL önceden ısıtılmış serumsuz astrosit ortamı (ABM-) aktararak 6 oyuklu steril bir plaka hazırlayın. Ekleri steril forsepslerle tutarak, endotelyal tam ortamı kan tarafından dikkatlice atın, eki ABM- içeren yeni plakaya yerleştirin ve 2,5 mL EBM-.
   ekleyin not: EBM- kullanımı, endotel bariyerinin kurulması için kritik öneme sahiptir.
4. Ekleri inkübatörde (% 5 CO₂ ile 37 ° C'de) 5 gün boyunca minimum fiziksel rahatsızlık ve sıcaklık değişimleri ile bırakın, bu da endotel bazal membranının üretimine, astrositin endotel hücreleri ile temasına ve nihayetinde BBTB taklit oluşumuna izin verir. Glioma hücre kültürlerinde transfer gününde ortamı değiştirin.

3. Glioma Hücrelerinin Hazırlanması

>NOT: Burada hasta kaynaklı glioblastoma küreleri kullanılsa da, aşağıdaki protokol U-87MG gibi yapışık, ticari olarak temin edilebilen glioblastoma hücreleri için kolayca uyarlanabilir.

1. İsteğe bağlı olarak, immünofloresan görüntüleme için, 2 mL poli-D-lizin (% 0.01) içeren 6 oyuklu bir plakaya oyuk başına dört adede kadar yuvarlak steril borosilikat lamel (ø 0.9 cm) yerleştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
2. Bu arada, tümör kürelerini hücre kültürü kabından steril bir serolojik pipet kullanarak 15 mL'lik steril bir tüpe dikkatlice aktarın. Tümör kürelerini 250 rcf'de 3 dakika santrifüjleyin.
3. Süpernatanı atın, küreleri 1 mL bFGF / EGF içermeyen (GBM-) glioma hücre ortamında nazikçe yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın. Hücre yoğunluğunu GBM- cinsinden yaklaşık 10⁴ küre/mL (10⁵ hücre/mL) olarak ayarlayın.
4. Poli-D-lizini kuyulardan atın ve steril PBS ile 3 kez durulayın. Plakayı 3 mL / kuyucuk tümör sferoid süspansiyonu ile tohumlayın ve ekleri BBB taklidi ile tümör hücresi süspansiyonu üzerine aktarın.
5. Testin kan ve beyin tümörü tarafları arasında dengeyi sağlamak için gece boyunca (% 5 CO₂ ile 37 ° C'de) inkübe edin. Ertesi gün, kan tarafındaki ortamı, ilgilenilen moleküller / ilaçlar / nanopartiküller ile desteklenmiş EBM ile değiştirin. Numuneler, önceki bölümde açıklandığı gibi doğrudan miktar tayini için zaman içinde toplanır. Hücreler, floresan görüntüleme için belirli bir zaman noktasında sabitlenir.

Sonuçlar

Şekil 1: Kan-beyin tümör bariyeri (BBTB) modelinin tanımı.(A) Farklı hücre tiplerinin konumlarının şematik gösterimi. (B) 6 oyuklu plaka kapağına ek yerleştirmenin ve ek parçanın zarının beyin tarafındaki astrositler için tohumlama tekniğinin çizimi. (C) Astrosit yapışmasına izin veren 6 oyuklu plaka yerleşiminin çizimi. (D) Sıkı bağlantı proteinleri zonula occludens-1 (...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hücre
bEND3	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-2299	Kültürlenmiş: % 10 FBS - 5 mL L-glutamin ve 5 mL penisilin / streptomisin ile desteklenmiş DMEM (1 g / L glikoz)
HIFko fare astrositlerini ölümsüzleştirdi	Dr. Gabriele Bergers Laboratuvarı'nda izole	https://doi.org/10.1016/ S1535-6108 (03) 00194-6	Kültürlenmiş: %5 FBS-5 mL 1 M HEPES-5 mL 100 mM sodyum piruvat- 3 g D-glikoz ve 5 mL penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş BME-1
HuAR2T Serisi	Dr. Dagmar Wirth Laboratuvarı'nda izole	https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184	Kültürlenmiş: SupplementMix ile EBM-2 normal insan birincil astrositleri Lonza CC-2565 Kültürlenmiş: SingleQuots'lu ABM
Malzeme ve Reaktifler
100 mm x17 mm Çanak Nunclon Delta	ThermoFisher Bilimsel	150350
10 mL serolojik pipet	ThermoFisher Bilimsel	170361
15 mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj Tüpleri	ThermoFisher Bilimsel	339650
ABM Bazal Orta 500 mL	Fransa	CC-3187	Birincil insan astrositleri için. ABM+: takviye karışımındaki tüm katkı maddelerini içerir. ABM-: rhEGF ve FBS dışındaki tüm katkı maddeleri
Accutase Hücre Ayırma Çözeltisi	Corning	25-058-CI
AGM SingleQuots Takviyeleri ve Büyüme Faktörleri	Fransa	CC-4123
B27 takviyesi	Gibco (Gibco)	17504-044	Hem GBM + hem de - orta için
Bazal Orta Kartal	ThermoFisher Bilimsel	21010046	BME-1
Corning Costar TC ile İşlem Görmüş 6 Kuyulu Plakalar	Sigma-Aldrich	CLS3506
Corning Transwell polyester membran hücre kültürü ekleri	Sigma-Aldrich	CLS3452
D-glikoz	Sigma-Aldrich	G8270	Ortama eklemeden önce 50 mL BME-1 ve steril filtrede çözün
Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle'ın Orta/Besleyici F-12 Jambonu	Gibco (Gibco)	21331-020	Laboratuvarımızda izole edilen hasta kaynaklı kürelerin kültürüne özel olarak; Diğer glioma hücre hatları için değişebilir
EBM-2 büyüme Orta Takviye Karışımı	Promosyon Hücresi	C-39216	EBM +: takviye karışımındaki tüm katkı maddelerini içerir. EBM-: VEGF-A ve FBS dışındaki tüm katkı maddeleri
Endotelyal Bazal Ortam 2 (EBM-2)	Promosyon Hücresi	C-22211	EBM +: takviye karışımındaki tüm katkı maddelerini içerir. EBM-: VEGF-A ve FBS dışındaki tüm katkı maddeleri
Fetal Sığır Serumu (FBS), nitelikli, ısı ile inaktive edilmiş, AB onaylı Güney Amerika Menşeli	ThermoFisher Bilimsel	10500056
Floresein sodyum tuzu	Sigma-Aldrich	F6377
Greiner CELLSTAR 96 kuyulu plakalar	Sigma-Aldrich	Greiner 655090	Siyah polistiren kuyuları düz tabanlı (mikro şeffaf tabanlı)
Menzel-GlÄser 0,9 cm yuvarlak borosilikat Örtü Astarı	Termo Bilimsel	10313573
PBS tabletleri	Medicago (Şifalı Bölge)	09-9400-100	Bir litre dH2O başına bir tablet; daha sonra çözeltiyi otoklavlayarak sterilize edin
Poli-D-lizin hidrobromür	Sigma-Aldrich	P6407 Serisi
Rekombinant İnsan EGF	Peprotech teknolojisi	GMP100-15	GBM+ orta için
Rekombinant İnsan FGF-temel (154 a.a.)	Peprotech teknolojisi	100-18B	GBM+ orta için

Serisi edildi edildi Serisi Serisi Serisi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Serisi Serisi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi